A fehérjék, peptidek diszulfidhídjainak fotodisszociációjával összefüggő szerkezeti és funkcionális változások tanulmányozásának, valamint a lebomlási folyamatok felderítésének biotechnológiai szempontból is óriási jelentősége van. Irodalmi adatok alapján az UVB sugárzás (280–315 nm) változást idéz elő a fehérjék (enzimek) szerkezetében, ami módosíthatja a biokatalitikus működésüket. Több fehérjénél, pl. a kecske α-laktalbumin (GLA) (Vanhooren et al., 2006) és az immunglobulin fehérjék (Illyés et al., 2014) esetében végzett korábbi kutatások a triptofán szerepének tisztázására irányultak, melyek szerint a diszulfidhidakhoz kellő közelségben lévő (d<7Å) aromás oldallánc fotonabszorbciója révén a szerkezetstabilizáló diszulfidhidak fotolízise bekövetkezhet energia-/elektrontranszfer folyamatokban (1. ábra). A diszulfidhíd fotoredukciója során keletkező szulfhidrilcsoportok in situ kimutatására többféle módszer, illetve reagens alkalmas; az egyik lehetséges kimutatás a tiolspecifikus reagensek/fluoreszcens jelzővegyületek alkalmazásával történhet, amelyek szelektíven, gyors reakcióban képesek megkötni a szabaddá váló szulfhidrilcsoportokat (-SH) (Sletten et al., 2009). A képződött festék-SH adduktok fluoreszcenciával detektálhatóak és a mért fluoreszcencia intenzitásváltozásából vonhatók le minőségi és mennyiségi következtetések.

1. ábra • Az UV-fény fotodisszociációt indukálhat

a fehérjeláncokon, amely során szabad szulfhidrilcsoportok keletkezhetnek.

Az UV-fény hatására lejátszódó fotokémiai reakció tanulmányozása a fehérjéknél kisebb egységeken, például peptidmodelleken is lehetséges, és egyszerűbbnek tűnik a fotolízist befolyásoló szerkezeti elemek szerepének tisztázása. Főleg triptofántartalmú (W), diszulfidhíddal (S-S) ciklizált modelleket állítottunk elő, ahol a triptofán aromás oldallánca és a diszulfidhíd közötti távolság várhatóan 5–10 Å: Ac-ciklo(CWKAC)-NH₂, Ac-ciklo (CAWAC)-NH₂ és Ac-ciklo (CWAGC)-NH₂ (2. ábra). (A ciklikus peptidek szekvenciájában az aminosavak egybetűs kódja szerepel, a továbbiakban a „ciklo” rövidítése: „c”.)

Az aminosavrész oldalláncának a diszulfidhíd fotolízisére gyakorolt hatását is tanulmányozni kívántuk, így az egyes modelleknél a szekvenciákban triptofán (W) helyett tirozin (Y) vagy fenilalanin (F), vagy valin (V) szerepelt. A fotolízis során képződő szulfhidrilcsoportok kimutatására és kvantitatív meghatározására különböző módszereket dolgoztunk ki, de figyelembe vettük, hogy a módszer egy összetettebb fehérje esetében is sikerrel alkalmazható legyen a szulfhidrilcsoportok lokalizálására és mennyiségi meghatározására, akár igen kis mennyiségben is.

Fluoreszcencia módszert alkalmaztunk az UV-besugárzás hatására keletkező szulfhidril-csoportok kvantitatív mérésére. A modellpeptidek oldatait oxigénmentesítettük, a besugárzást 290 nm-es hullámhosszon végeztük (16 nm rés-szélesség, 60 perc besugárzási idő, kevertetés 4 °C hőmérsékleten, argon atmoszféra) a Jobin-Yvon Fluorolog 4 spektrofluoriméter 450W teljesítményű xenon lámpájával puffer oldatban (pH~7,5), 185–220 μM peptidkoncentrációnál. Az UV-besugárzáskor keletkező szulfhidrilcsoportok kimutatására a szulfhidrilszelektív fluoreszcens reagenst, a 7-dietilamino-3-(4-maleimidofenil)-4-metilkumarint (Ayers et al., 1986) (CPM; l_ex=387 nm, l_em=475 nm) használtuk, mivel a keletkező addukt erősebben fluoreszkál, mint maga a reagens (3. ábra).

A molekulamechanikai (MM) számításokkal kapott triptofán-diszulfidhíd (W-SS) távolságokat figyelembe véve, a várt sorrend a fotolitikus reakcióban keletkező szulfhidril mennyiségére az Ac-c(CWAGC)-NH2 < Ac-c(CWKAC)-NH2 < Ac-c(CAWAC)-NH2 lenne. Kísérleteink alapján megállapítottuk (1. táblázat), hogy a fluoreszcencia alapján meghatározható sorrend Ac-c(CWKAC)-NH₂ < Ac-c(CAWAC)-NH₂ < Ac-c(CWAGC)-NH₂. Így célszerűnek látszott a CPM fluoreszcens jelzőmolekulát tartalmazó lineáris és ciklikus pentapeptid modellek vizsgálata tömegspektrometriával, annak érdekében, hogy a kísérlet során keletkező termékeket (CPM-adduktok) azonosítani tudjuk.

A tandem tömegspektrometria (Bruker Esquire 3000+ ioncsapda, elektrospray ionforrással) az addukt keletkezését igazolja, és a későbbiekben a kvantitatív szulfhidril-meghatározást is lehetővé teszi. Munkánk során részletesen tanulmányoztuk a CPM-jelzőmolekula pozíciójának hatását a peptidek MS/MS fragmentációjára. A tandem tömegspektrometriás mérések során ütközésindukált disszociációt (CID) alkalmaztunk. Eredményeink azt mutatják, hogy a CPM fluoreszcens jelzőmolekula segítségével történő kvantitatív szulfhidril-meghatározás jól kombinálható a tandem tömegspektrometriára épülő szerkezetvizsgálati módszerekkel, mivel a jelzővegyület karakterisztikus módon befolyásolja a peptidek MS/MS fragmentációját. A tandem tömegspektrumokban intenzíven jelentkeznek a módosulást hordozó fragmens-ionok, függetlenül attól, hogy a peptiden belül melyik cisztein hordozza

a jelzőmolekulát. A karakterisztikus fragmensionok alapján a módosulás helye a szekvenciában pontosan lokalizálható, és lehetőség nyílik az egyes módosulási pontok nagy érzékenységű, kvantitatív meghatározására is. Nagy felbontású LC-MS vizsgálataink (Waters Q-TOF Premier) szerint a keletkező CPM–peptid adduktok mellett több melléktermék is azonosítható, amelyek több csúcsban jelennek meg a kromatogramokban. Azonosítottuk a ciklikus peptidek tioéter-, illetve oxidált triptofánt tartalmazó származékait (több csúcsban) (Mozziconacci et al., 2010); a ciklikus peptideket, illetve a peptidek dimerjeit; a CPM-peptid adduktok szerkezeti izomerjeit (több csúcsban).

NMR-spektroszkópiával azért vizsgáltuk a ciklikus modellpeptidek térszerkezetét, hogy meghatározzuk az oldatbeli konformerekben a fotolitikus viselkedés szempontjából fontosnak vélt Trp–SS távolságot. A peptideknél szokásos NMR jelhozzárendelési és szerkezetmeghatározási stratégiát követve, kétdimenziós (2D) kísérletek (1H-1H COSY, TOCSY, ROESY és 1H-13C HSQC) sorozatát végeztük 500 MHz protonfrekvencián. A ROESY-spektrumok alapján nyert, molekulán belüli proton–proton távolságok felhasználásával az energiaminimalizált szerkezetek sokaságát kaptuk, amelyekből reprezentatív konformereket választottunk ki. A további szerkezetfinomításhoz, valamint a másodlagos szerkezeti elemek statisztikai értékeléséhez molekuladinamikai számításokat végeztünk. A másodlagos szerkezetet stabilizáló hidrogénkötések jelenlétét az amidprotonok kémiai eltolódásának hőmérsékletfüggése alapján igazoltuk. Eredményeink alapján megállapítottuk, hogy ugyan a kapott konformerek hasonlóak, de kisebb különbségek mutatkoznak – feltehetőleg a másodlagos szerkezetek eltérő arányának tulajdoníthatóan – mind a főlánc konformációjában, mind a flexibilis oldalláncok elhelyezkedésében. A fotolízis szempontjából fontosnak gondolt triptofán-diszulfidhíd (W-SS) és triptofán-lizin (W-K) oldalláncok közötti távolságok előfordulási valószínűsége a konformerek sokaságában a 2. táblázatban van összesítve. A kapott értékek összhangban vannak az MM-számítások eredményével.

ESR-spektroszkópiai vizsgálatokat végeztünk annak érdekében, hogy az UV-besugárzás hatására felszakadó diszulfidhidakból keletkező tiil-gyököket csapdázzuk. Méréseinkben a szabadgyök befogására 5-(dietoxifoszforil)-5-metil-1-pirrolin-N-oxid (DEPMPO) vegyületet használtunk, UVB- (280–320 nm) és UVA-tartományú (320–380nm) besugárzás mellett, DTPA-t tartalmazó foszfátpufferben (pH~7,4). Eredményeink azt mutatják, hogy még az argongázzal oxigénmentesített pufferoldatokban is számolni kell olyan fotodisszociációkkal, melyek hidroxil-gyökök képződéséhez vezetnek. A diszulfidhidakat tartalmazó peptidek gyökös fotodisszociációjakor, a vizes oldatokban képződő szulfhidrilcsoportok mint redukálószerek, hatékonyan redukálják a DEPMPO-val képződött nitroxid-szabadgyököket, amelyek EPR-inaktív hidroxilaminokat eredményeznek. A keletkező hidroxilaminokat K3Fe(CN)6 mint enyhe oxidálószer segítségével visszaoxidálva a csapdázott gyökök között elsősorban hidroxilgyökök, illetve széncentrumú szabadgyökök detektálhatók. Ezek kvantitatív meghatározása azonban csak további részletes mérések alapján lehetséges.

• Eredményeink azt mutatják, hogy a tandem tömegspektrometria mint módszer, a CPM-jelzőmolekula segítségével alkalmas a kvantitatív szulfhidril-tartalom meghatározására.

• Az ESR-spektroszkópiai eredményeink jelzik a diszulfidhidak felszakadása következtében keletkező szabadgyök-képződést, de a tiil-gyökök kvantitatív mérése csak további vizsgálatok alapján lehetséges.

• Figyelembe véve a modell peptidek térszerkezetét és a fotolízisük eredményeit, úgy tűnik, hogy kistagszámú peptidek esetében a W–SS távolságnak nincsen meghatározó szerepe az UVB sugárzás hatására lejátszódó fotolízisben. Ennek bizonyításához más modellek (a ciklikus modellekben W helyett Y, F, V aminosav) teljes körű konformáció- és fotolízis-vizsgálata, valamint a fotolízis termékeinek további analízise szükséges.
 

A kutatás az OTKA (K 100720 M. Zs., K 105459 K. K.) és az MTA–MedInProt támogatásával valósult meg. Dr. Schlosser Gitta és Dr. Borics Attila munkáját a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj támogatta.
 

Kulcsszavak: ciklopeptidek, diszulfidhíd, fotolízis, szulfhidrilcsoport, fluoreszcencia, tandem tömegspektrometria, LC-MS/MS, NMR-spektroszkópia, szabadgyök-csapdázás, ESR-spektroszkópia
 

HIVATKOZÁSOK

Ayers, Frank C. – Warner, G. L. – Smith, K. L. – Lawrencem D. A. (1986): Fluorometric Quantitation of Cellular and Nonprotein Thiols. Analytical Biochemistry. 154, 186–193. DOI:10.1016/0003-2697(86)90513-0

Illyés Eszter – Staelens, S. – Vanhooren, A. – Deckmyn, H. – Hanssen, I. – Majer Zs. (2014): Role of the Trp-disulfide Triads in the UV Light Induced Degradation of a Monoclonal Antibody scFv. International Journal of Biochemistry Research & Review. 4, 5, 367–385. DOI:10.9734/IJBCRR/2014/8453 • WEBCÍM

Mozziconacci, Olivier – Kerwin, B. A. – Schöneich, C. J. (2010): Photolysis of an Intrachain Peptide Disulfide Bond: Primary and Secondary Processes, Formation of H2S, and Hydrogen Transfer Reactions. The Journal of Physical Chemistry. B. 114, 3668– 3688. DOI: 10.1021/jp910789x

Sletten, Ellen M. – Bertozzi, Carolyn R. (2009): Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6974–6338. DOI: 10.1002/anie.200900942 • WEBCÍM

Vanhooren, Ann – Illyés E. – Majer Zs. – Hanssens, I. (2006): Fluorescence Contributions of Individual Trp Residues in Goat a-lactalbumin. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1764, 1586–1591. DOI:10.1016/j.bbapap.2006.07.011 • WEBCÍM

Ac-c(CWKAC)-NH₂

Ac-c(CAWAC)-NH₂

Ac-c(CWAGC)-NH₂

Ac-c(CWKAC)-NH₂

Ac-c(CAWAC)-NH₂

Ac-c(CWAGC)-NH₂