A Szegedi Biológiai Központ Genetikai Intézetében a kromoszómakutatás kezdetei a Belea Adonisz vezette Búza Evolúciógenetikai Csoporthoz köthetők. Valós és feltételezett búzaősök változatos keresztezéséből származó hibridek tulajdonságai alapján tervezték megfejteni a termesztett búza – abban az időben még ismeretlen – származását. Nyilvánvaló volt, hogy megbízható eredményekhez elengedhetetlen a szülők és hibridek citogenetikai vizsgálata, ami gyakorlatilag kromoszómaszámok megállapítását és a kromoszómamorfológia alapján történő kariotípus-vizsgálatokat jelentette.

Ez idő tájt Magyarországon a citogenetika nem volt része az egyetemi tananyagnak, a genetikai, sejtbiológiai tankönyvek is jószerével csak rajzolt képeken keresztül mutatták be a kromoszómákat. Így történhetett, hogy egy dunántúli mezőgazdasági termelőszövetkezet frissen végzett agrármérnök főállattenyésztője, Hadlaczky Gyula kapott meghívást, hogy legyen a Búza Evolúciógenetikai Csoport „kromoszómanéző” tudományos segédmunkatársa. A némileg szokatlan meghívás magyarázata az volt, hogy Hadlaczky Gyula 1972-ben egyetemi hallgatóként az Országos Diákköri Konferencián növényi kromoszómák vizsgálatáról szóló dolgozatával az MTA első díját nyerte, és erre valaki, valamilyen úton-módon emlékezett.

1973-ban megkezdődött a búza, búza fajhibridek és egyéb fűfélék nagyüzemi kromoszómaszámolása. Több száz csíranövény több ezer gyökércsúcs-preparátumának monoton vizsgálatába szomorodva, egy késő esti beszélgetés csillantotta meg a „menekülés” halvány esélyét. Dudits Dénes, a Genetikai Intézet fiatal munkatársa vetette fel: „van valami C-sáv festés (a kromoszómák heterokromatikus régióinak erős, sávszerű festődése), amivel elkülöníthetők az egyes kromoszómák, ki kéne próbálni, hátha igaz!” Néhány hónapos próbálkozás után sikerült a módszert adaptálni a gabonafélék kromoszómáira, és a tritikáléban (búza-rozs hibrid) C-sáv festéssel egyértelműen azonosítani az egyes rozskromoszómákat. Ezt követte a búza evolúciógenetikai vizsgálatokban való alkalmazása. A termesztett hexaploid búza (42 kromoszómás) egyik feltételezett őse, a kecskebúza (14 kromoszómás) kromoszómáinak C-sáv-festése alapján kizárható volt, hogy e faj hozzájárult a termesztett búza kialakulásához. Ez az eredmény volt az SZBK első, nemzetközi folyóiratban megjelent, kromoszóma tárgyú közleménye.

Itt érdemes egy rövid kitérőt tenni. 1974-et írunk, a Genetikai Intézet kutatói szinte valamennyien harminc év alatti kezdők, egy „Csapat”. A kromoszómák sikeres C-sáv-festésének nem volt előfeltétele a hibátlan angoltudás. Így történt, hogy a szedett-vedett, hibáktól hemzsegő angol mondatokból összeeszkábált kecskebúza-kromoszómás cikket Raskó István orvos, emlős-sejtgenetikus tette „szalonképessé”, gyakorlatilag ő írta meg. Akkoriban a „köszönetnyilvánítás” még nem volt általános részük a tudományos közleményeknek, így a történetet csak az emlékezet őrzi.

A C-sáv-festéses kutatások koronája a kukoricahibridek kromoszómavizsgálatának eredménye volt. Sikerült bizonyítani, hogy a kukoricavonalak kromoszómáinak heterokromatikus mintázata (C-sáv) egyszerű mendeli öröklésmenetet mutat, kukoricahibridekben a nagyszülői kromoszómák is azonosíthatók (1. ábra). Nyilvánvalóvá vált, hogy némi módosítással a kromoszómák C-sáv-festése adaptálható a növényvilág mintegy négyszázezer leírt fajára, és ez „életfogytig tartó megélhetést” biztosíthat. A búza evolúciógenetikai csoporthoz kötöttség feloldásával, amely a Genetikai Intézet akkori igazgatójának, Alföldi Lajosnak volt köszönhető, lehetővé vált valami új irány keresése. Megkezdődött a „kalandozások” kora.

Az 1970-es évek első fele a molekuláris genetika és a protoplaszt (sejtfaluktól megfosztott növényi és baktériumsejtek) korszakának nyitánya volt a világban és az intézetben is. A baktériumsejtek protoplasztálása, fúziója, regenerálása baktériummá, növényi protoplasztok-sejtek regenerálása teljes növényekké, szomatikus faj- és nemzetséghibridek előállítása, növényi protoplasztok fúziója állati sejtekkel (2. ábra) citológiai kincsesbánya volt.

2. ábra • Növényi protoplaszt (NP) és emlőssejt (ES) összeolvadásának pásztázó elektronmikroszkópos képe

Lehetőséget adott az elérhető vizsgálómódszerek megtanulására, és minden, ami fénymikroszkóppal, transzmissziós vagy pásztázó elektronmikroszkóppal nézhető-látható volt, annak a vizsgálata megtörtént. A Raskó István vezetésével dolgozó emlős szomatikus sejtgenetikai csoport sejthibridizációs kísérletei, az emlőssejtek kromoszómáinak könnyebb „kezelhetősége”, az intézeten belüli együttgondolkozás-együttdolgozás természetessége és az amerikai Ernest J. DuPraw lenyűgöző elektronmikroszkópos kromoszómaképei alapvetően megváltoztatták a kromoszóma-kutatások irányát. A napi feladatokon túl, a DuPraw-féle whole-mount elektronmikroszkópos technika autodidakta elsajátítása (3. ábra) és a Raskó-csoport önzetlen sejtforrása lehetőséget adott az emlőssejtek kromoszómáinak legmodernebb eszközökkel történő vizsgálatára.

3. ábra • Emberi kromoszómák elektronmikroszkópos képe

A nemzetközi kromoszómakutatás nagy szenzációja a 70-es évek végén a „kromoszóma váz”-elmélet (scaffold model) megszületése és kísérletes bemutatása volt. Az Egyesült Államokban Kenneth W. Adolph, James R. Paulson és Ulrich K. Laemmli Cell- és PNAS- (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA) cikkekben közölték, hogy a kromoszómák „végső” szerkezeti eleme (részleges fehérjétlenítés és DNáz-kezelés után) egy folytonos fehérjeváz, amely mentén a DNS hatalmas hurkokba szerveződik. Egy Wellcome Trust ösztöndíjnak köszönhetően, az edinburgh-i MRC Klinikai és Populációs Citogenetikai Intézetben eltöltött egy év alatt sikerült kísérletesen bizonyítani, hogy a részlegesen fehérjétlenített és DNS-mentesített kromoszómák elektronmikroszkópos felvételein látható folytonos fehérjeváz valójában különálló fehérjerészecskék mesterségesen előidézett aggregációja (4. ábra).

4. ábra • Kínai hörcsög kromoszómájának elektronmikroszkópos képe a kromoszómafehérjék részleges eltávolítása után. A legvégső felismerhető struktúra a centromer, a kromoszómakarokat a fehérjerészecskék eltérő sűrűsége rajzolja ki.

Tehát, ha létezik egy folytonos kromoszómaváz, akkor annak feltétlen tartozékai a bizonyos szerkezeti szereppel bíró DNS-szakaszok. Nem-zetközi szinten, néhány hasonló következtetésre jutó kutató kivételével, a vázmodell „rajongói tábora” nem fogadta kitörő lelkesedéssel az eredményeket leíró közleményeket. Ennél fontosabb azonban, hogy ezek az eredmények alapozták meg a Biokémiai Intézet kitűnő biokémikusával, Udvardy Andorral (aki kromatinszerkezeti munkái alapján „vázmodell-szkeptikus”) a máig tartó együttműködést és barátságot.

A 80-as évek elején a kutatók meghatározott forint „fejpénzzel” és évi 90 amerikai dollár „import-vegyes” (egy évvel előre megrendelt devizás vásárlásokra fordítható) ellátmánnyal rendelkeztek. A skóciai intézet ajándéka (mintegy 3000 font értékű vegyszer és eszköz) kivételes lehetőséget adott a kromoszómaszerkezeti munkák folytatására.
Az egyfős kromoszóma-csapat státuszproblémák miatt egy takarítónőnek álcázott technikussal és két növényi szövettenyésztős „vendégmunkással” megerősödve nemzetközi szinten is egyedülálló eredményeket ért el. Kidolgozták a növényi kromoszómák és sejtmagok tömegizolálását, és a növényi kromoszómák biokémiai, immunológiai és szerkezetvizsgálatával igazolták, hogy a növényi és állati kromoszómák alapvető felépítése azonos.

A kromoszómaszerkezeti vizsgálatokból kiderült, hogy a kromoszómák fokozatos leépítése (fehérje- és DNS-kivonás) során a legvégső szerkezeti elem a centromer. A centromer felépítésében több konzervált fehérje is részt vesz, amelyek ellen specifikus ellenanyagok találhatók bizonyos autoimmun betegek vérszérumában. Erre alapozva született meg 1985-ben annak a kísérleti programnak a gondolata, amelynek célja az emlős mesterséges kromoszóma előállítása volt (5. ábra).

Az elképzelés lényege az, hogy a humán osztódó sejttenyészetből izolált kromoszómák részleges fehérjétlenítése és DNáz-kezelése után anticentromer ellenanyagokkal elvileg kinyerhetők a centromerikus szakaszok, illetve az azokba zárt centromerikus DNS. E DNS-szakaszok klónozásával vagy ezeket próbaként használva, humán DNS-bankból történő izolálással nagy mennyiségű centromer-DNS állítható elő. A centromer-DNS-t a kromoszómaműködés szükséges elemeivel (replikációs szakasz, telomer, jelzőgén) összeépítve és emlőssejtekbe juttatva esély van új kromoszómák létrehozására.

Több száz magyar és svédországi autoimmun beteg szérumának vizsgálata során sikerült egy olyan nagytisztaságú specifikus anticentromer-savót találni, amelyben öt különböző centromer-fehérje elleni antitestek találhatók (lásd a 6., 7. és 8. ábrákat).

Az anti-centromer szérum első felhasználása annak a kísérletes bizonyítása volt, hogy az emlősök testi sejtjeinek magjában a kromoszómák nem véletlenszerűen, hanem meghatározott rendben helyezkednek el. Az anyai és apai homológ kromoszómák párba rendeződésén túl a nem homológ kromoszómák tükörszimmetriát mutató csoportokat alkotnak (6. ábra). A kromoszómák nem véletlenszerű elrendeződése – ennek a génexpresszióval, a genom működésével kapcsolatos összefüggése – ma már tankönyvi adat.

A Raskó-csoport sejttenyésztő infrastruktúráján „élősködve” és DNS-munkákban jártas munkatársa, Burg Kornél tudását használva hosszas próbálkozás és kudarcok sorozata után sikerült használható mennyiségű anti-centromer szérummal kitisztított DNS-t előállítani. E DNS szolgált próbaként egy feltételezett centromerikus DNS kihalászására egy humán DNS-könyvtárból. Bakteriofág-„szigetelő”

DNS-szakaszok és egy szelektálható jelzőgénnel történt összeépítés után megkezdődtek a DNS-beviteli kísérletek. 1989 végén megszülettek azok a sejtvonalak, amelyekben a bevitt DNS-ből felépült új centromerek, illetve önálló minikromoszómák képződtek (7. ábra). A jelenség ismételhetőnek bizonyult, és hamarosan a minikromoszómák méretét többszörösen meghaladó, új kromoszómát hordozó sejtvonalakat is sikerült előállítani olyan DNS bevitelével is, amely nem tartalmazott feltételezett centromerikus DNS-t (8. ábra). Nyilvánvalóvá vált, hogy a centromer- és kromoszómaképződés nem a bevitt DNS specifikus bázissorrendjétől függ.

Ezt az időszakot a töretlen lelkesedés és a pénzhiány jellemezte. A napi túlélésért folyó küzdelemben és a minikromoszóma megszületésében döntő szerepe volt az SZBK akkori főigazgatójának, Keszthelyi Lajosnak. Fizikus-biofizikusként a mesterségeskromoszóma-program kezdetétől állandó érdeklődéssel követte a munkát, és az ínség időszakában személyes közbenjárására – pályázaton kívül kapott – mintegy kétmillió forint OMFB-„segély” biztosította a túlélést. Az első eredmények közlése (két PNAS-cikk) jelentős nemzetközi érdeklődést váltott ki. A közlést és a további munkák pénzügyi hátterét a szerencse és a személyes kapcsolatok határozták meg. 1989-ben két amerikai professzor (egyikük Szalay Aladár, az SZBK Növényélettani Intézetéből a 70-es években „külföldre szakadt” hazánkfia), hasznosítható alapkutatási eredményekre „vadászva” az SZBK-ban úgy vélte, hogy ez a minikromoszóma egyike a lehetséges értékesíthető eredményeknek. Szalay Aladár kapcsolatai révén a kanadai Alberta tartományi kormány kutatástámogatása, majd egy amerikai óriásvállalat biztosította a kutatások részbeni finanszírozását, a kutatási eredmények szabadalmaztatási költségeit az esetleges, jövőbeni szabadalmak hasznosítási jogáért cserébe. Itthon, 1991-ben, az akkori földművelésügyi miniszterrel mint társpályázóval elnyert hároméves OMFB-pályázat keretében mintegy húszmillió forint biztosította a további munka pénzügyi hátterét. Így az amerikai és az OMFB kutatási támogatás révén az elkövetkező négy-öt év anyagi biztonsága lehetővé tette az aprólékos kísérleti munkát, amelynek eredményeként – elsősorban egy nagyméretű, egérsejtekben előállított új kromoszóma révén – kiderült, hogy a kromoszómaképződés egy, a sejt meghatározott kromoszómáinak centromerközeli szakaszába épült „idegen” DNS által előidézett megsokszorozódás eredménye (9. ábra). Az újonnan képződő kromoszómák tehát az élő sejtben történt beavatkozás eredményei. A stabil fennmaradásukhoz és működésükhöz szükséges elemeket a „természetes” kromoszómák meghatározott szakaszainak megsokszorozódása révén „szerzik” meg, DNS-összetételük kevésbé komplex, elsősorban ismétlődő, azonos bázissorrendű szakaszokból épülnek fel, így jelentősen eltérnek a „természetes” kromoszómáktól. Ez a tény, és az, hogy az újonnan képződött „mesterséges” kromoszómák genetikai tartalma – a tandem ismétlődő riboszomális RNS-génektől eltekintve – kizárólag a kívülről bevitt génekre korlátozódik, indokolja a „mesterséges” jelzőt.

A centromerközeli szakaszok döntően heterokromatinból (erősen „becsomagolt”, géneket nem hordozó, ismétlődő, ún. szatellit DNS-szakaszok) épülnek fel, így az újonnan képződött kromoszómák alapanyaga is főként szatellit DNS (10. ábra).

Ebből a tulajdonságukból adódóan a szatellit DNS-alapú mesterséges kromoszómák (SATAC) gyakorlatilag 100%-os tisztaságban elválaszthatók a „természetes” kromoszómáktól kettős, lézervezérlésű áramlásos citometriával (11. ábra).
Erre az időszakra esett, hogy az amerikai támogatás (a mesterséges kromoszómáktól független okok miatt) megszűnt, viszont a munka folytatását célzó, nagy ívű négyéves kutatási pályázatra, a munkatervet változatlanul hagyva, az OTKA megadta a kért kutatási támogatás 5%-át, azaz évi 200 000 Ft-ot. A teljes pályázati összeg éppen fedezte annak a két közleménynek a publikációs költségeit, amelyek a szatellit DNS-alapú mesterséges kromoszómák prototípusának leírását, illetve a kromoszómaképződés alapvető folyamatainak tisztázását és ezáltal az ismételhető kromoszómaépítés módszerének kidolgozását írták le.

Itt újra érdemes egy rövid kitérőt tenni, ami rávilágít az esélyegyenlőségre és a globális tudomány geográfiai és etikai fehér foltjaira. A fent említett két közlemény kétségkívül az első közlése volt az emlős mesterséges kromoszómák ismételhető előállításának. Egy évvel később az Egyesült Államokban megjelent mesterséges kromoszóma előállítását leíró közleményt a média jelentős csinnadrattával mint világelső felfedezést ünnepelte. Joggal, hiszen a szerzők említést sem tettek az őket megelőző négy, Magyarországról származó munkáról. A dolog pikantériája, hogy az amerikai szerzők, a tudományos közleményük megjelenésével egy időben benyújtott szabadalmukban oldalakon keresztül próbálják bizonygatni, hogy eljárásuk különbözik a négy szegedi közleményben leírtaktól.

A pénztelenségből fakadó lét-nemlét dilemma feloldása Kanadából érkezett. A mesterséges kromoszómák ismételt előállítását, illetve a mesterségeskromoszóma-tisztítás eredményeit ismerve, egy kanadai üzletember 1995 végén bejegyeztette a vancouveri székhelyű Chromos Molecular Systems nevű biotechnológiai vállalatot, amely a szatellit DNS-alapú mesterséges kromoszómák biotechnológiai alkalmazását, a SATAC-technológia kifejlesztését tűzte ki célul. A Chromos 1996-ban kizárólagos hasznosítási licencszerződést kötött a Szegedi Biológiai Központtal, és hosszú távú kutatási szerződést írt alá az SZBK Genetikai Intézetével. E szerződések keretében vállalta az évi rendszeres kutatási támogatás biztosítását, a kutatási eredmények szabadalmaztatási költségét, a technológia majdani hasznosításából származó bevételekből – a nemzetközi normáknak megfelelő – jogdíj fizetését. A Chromos létrehozta saját kutató-fejlesztő laboratóriumát, és 1997-ben megkezdődött a közös kutatómunka és technológiafejlesztés. Ennek főbb eredményei a következők voltak:

• a mesterséges kromoszómák ipari méretekben történő tisztítása,

• „hasznos” géneket hordozó mesterséges kromoszómák előállítása,

• humán szatellit-DNS-alapú mesterséges kromoszóma prototípusának előállítása (12. ábra),

• genetikailag módosított állat előállítása tisztított mesterséges kromoszómával (13. ábra),

• genetikailag módosított állat előállítása szövetspecifikus génkifejeződést biztosító tisztított mesterséges kromoszómával,

• lipidekbe csomagolt tisztított mesterséges kromoszómák bevitele célsejtekbe,

• feltölthető, mesterséges kromoszóma expressziós rendszer létrehozása (14. ábra),

• ipari fehérje-gyógyszeralapanyagot termelő mesterséges kromoszómák előállítása.

12. ábra • Emberi mesterséges kromoszóma prototípus (*) természetes társai között DNS-hibridizáció human szatellit DNS-sel (zöld és piros), illetve centromer immunfestés (kettős, világos pöttyök), a kromoszómák kék színét egy DNS-specifikus fluoreszcens festék adja

2000-ben a Chromos a torontói tőzsdén nyílt részvénytársasággá vált, ettől kezdve a vállalati stratégiát, beleértve a kutatási-fejlesztési célokat, irányokat a befektetők rövid távú érdekei (gyors tőkemegtérülés) határozták meg. 2004-ben a mesterséges kromoszóma expressziós rendszer létrehozásakor az elsődleges stratégiai irány a gyógyszeripari fehérjetermelés lett. Ez azt is jelentette, hogy a kutatás-fejlesztés kizárólagos iránya a gyógyszeripari fejlesztés, amelyet az elsődlegesen alapkutatást végző Genetikai Intézet Kromoszóma Csoportja nem vállalhatott. A kutatási szerződés (és a kutatási támogatás) megszűntével, hazai pályázati forrásból és az utolsó, jelképes Chromos-támogatásból 2005-ben elindult egy kísérletsorozat, amely a mesterséges kromoszóma és az őssejttechnológia ötvözésével a mesterséges kromoszómák génterápiai alkalmazhatóságát kívánta igazolni. Ennek szakmai hátterét a meglévő „kromoszóma csapat” tudása mellett, a hároméves tanulmányútról hazatért és magát őssejtszakértővé kiképező Katona Róbert biztosította. A modellkísérlet egy ma még gyógyíthatatlan betegség (Krabbe-betegség) egérmodelljének kezelése volt terápiás emlős mesterséges kromoszómát hordozó embrionális őssejtekkel. A hároméves kísérletsorozat eredményei igazolták, hogy a kombinált mesterséges kromoszóma-őssejt technológia alkalmas eszköze lehet az ex vivo génterápiának (15. ábra).

2006 nyarán a Pfizer gyógyszeripari óriásvállalat nyilvánosságra hozta saját összehasonlító vizsgálatainak eredményét, miszerint a mesterséges kromoszómarendszerrel bioreaktorokban literenként 4 grammot meghaladó fehérje-gyógyszeralapanyag termelése érhető el, amely ötszörösen meghaladta saját fehérjetermelő rendszerük teljesítményét.

Ezek az eredmények döntő szerepet játszhattak abban, hogy a Pfizer legnagyobb versenytársa, a GlaxoSmithKline 2007-ben megvásárolta a mesterségeskromoszóma-technológia fehérjetermelésben történő felhasználásának jogát a forráshiánnyal küszködő Chromostól. A technológia transzgenikus és génterápiai felhasználásának joga a Chromosnál maradt. A többéves közös munka és a Chromos vezetésével meglévő jó kapcsolatoknak köszönhetően a Chromos licencszerződés keretében teljes körű felhasználási jogot adott a Szegedi Biológiai Központ számára a mesterségeskromoszóma-technológia magyarországi génterápiai, gyógyító célú felhasználására. A teljes körű felhasználás kiterjed a negyvenkilenc mesterségeskromoszóma-tárgyú szabadalmaink hasznosítására, amelyek tulajdonosa a Szegedi Biológiai Központ, illetve magában foglalja a Chromos saját fejlesztéseit is.

Az első modellkísérlet sikerére alapozva, hazai és Európai Uniós pályázatok keretében, jelenleg három mesterséges kromoszóma-őssejt technológiára alapozott preklinikai kutatási program folyik állatmodelleken, illetve sejtszinten: 1. Egy életmentő génterápiai kezelés súlyos mellékhatásának (a terápiás gént hordozó vektor által okozott leukémia) lehetséges kiküszöbölése mesterséges kromoszómavektorral. 2. Egy mesterséges kromoszómával két vagy több terápiás cél elérésének egyidejű megvalósíthatóságát igazoló daganatterápiás modellkísérletek. 3. Idegrendszeri betegségek lehetséges kezelési eljárásainak kidolgozása mesterséges kromoszómával genetikailag módosított terápiás őssejtekkel.

Az elmúlt évek során a Genetikai Intézetben sikerült létrehozni egy olyan preklinikai egységet, amely elvileg alkalmas bármely génterápiai szempontból releváns betegség állatmodelljének mesterséges kromoszóma-őssejt terápiával történő kezelésére.

A szegedi „kromoszóma csapat” szűkebb és tágabb értelemben vett tagjaira vonatkozóan eligazítást adnak az intézeti publikációs lista szerzői névsorai. Ám lehetetlen felsorolni mindazok nevét, akik az elmúlt közel négy évtized során, itthon és világszerte munkával, tanáccsal, kritikával, segítséggel vagy csak jóindulatú érdeklődéssel járultak hozzá, hogy a szegedi kromoszómakutatás eredményei nemzetközi szinten is tankönyvi adatokká válhattak, és az alapkutatási eredményekből használható technológia született.

Kulcsszavak: génterápia, kromoszómastruktúra, mikroszkópia, mesterséges kromoszóma, őssejt, sejtfúzió, szatellit DNS, transzgenikus egér