Célkitűzések

Hazánk népegészségügyi szempontból egyik stratégiai problémáját már évtizedek óta a rosszindulatú daganatos betegségek jelentik. Bár az elmúlt években paradigmaváltásnak lehetünk szemtanúi a daganatos betegségek kezelésében, mind a mai napig hazánkban 35 ezer beteg hal meg évente és közel 75 ezer új beteget fedeznek fel. Ennek a hatalmas betegpopulációnak (becslések szerint 200 ezer beteg) sorsának jobbra fordulása csak a legkorszerűbb bio- és géntechnológiai eljárások csatasorba állításától, az igazi evidenciaalapú gyógyítástól várható. A Semmelweis Egyetem hazánk egyik rákgyógyászati központja a maga évi 15–20 ezer fekvő- és sok százezres daganatos járóbeteg forgalmával, akik gyakorlatilag lefedik a hazai rákepidemiológia szinte teljes palettáját. A klinikai onkológia paradigmaváltása gyakorlatilag a molekuláris medicina megvalósulásának köszönhető, az onkológia területén létrehozva a molekuláris onkológiát. Ennek a gyakorlatban két meghatározó ága fejlődött ki a szemünk láttára: a molekuláris diagnosztika és a molekuláris terápia. A transzlációs kutatások az igen költséges célterápiák racionális (szakmai értelemben) és költséghatékony (OEP-finanszírozás) alkalmazásának teremtheti meg a protokolláris és evidenciákra alapozott alapjait. A daganatos betegség komplex, mivel a szervezet sorsát nemcsak az agresszív daganat, hanem a gazdaszervezet válaszreakciója, illetve annak hiánya, valamint általános (kóros) állapota, kísérőbetegségei legalább annyira befolyásolják. Hazánkban különösen gyakran kell azzal szembenéznünk, hogy a leggyakoribb népbetegségek, az ateroszklerózis, a diabétesz, a neurodegeneratív kórképek együttesen fordulnak elő a daganatos betegséggel. Ennek fényében egyértelmű, hogy a rákbetegek esetében a daganat elleni terápiát hatékonyan kell kombinálni az egyéb betegségek kezelésével: nem szabad interferálni a citotoxikus vagy célzott kezelésekkel, ugyanakkor optimális állapotba kell hozni a gazdaszervezetet, hogy hatékony legyen a daganat elleni küzdelemben.

Mindezek figyelembevételével
kutatás-fejlesztési programunkat
az alábbiakban határoztuk meg:

Rosszindulatú daganatok esetében elemezzük, hogy

1. a primer vagy az áttéti tumor genotípusára érdemes-e alapozni a kezelést;

2. a kemoterápia iránti érzékenységet multigén-mintázat alapján lehet-e jósolni;

3. megkísérlünk molekuláris célpontot azonosítani májrákban, illetve

4. malignus melanómában.

A haematopoetikus daganatok esetében jellemezzük

1. a krónikus mieloid leukémia és

2. a B-sejtes non-Hodgkin-limfóma genetikai progresszióját, valamint

3. elemezzük a mikrokörnyezet moduláló szerepét.

A daganatos beteg vonatkozásában

1. vizsgáljuk, hogy az endoplazmás retikulum lehet-e a metabolikus szindróma új terápiás célpontja;

2. tanulmányozzuk a G-fehérjékhez kapcsolt receptorok működésének mechanizmusát kóros és normál körülmények között, terápiás lehetőségek feltárása céljából;

3. neurodegeneratív kórképek esetében hatékony(abb) terápiás elveket kívánunk megvizsgálni, végül

4. mikropartikulum-alapú új antiszeptikus terápiás eszközt dolgozunk ki.

Eredmények

Célkeresztben a szolid daganat
(Dr. Tímár József)

A daganatos betegek disszemináció miatt hunynak el, azonban a végső stádiumú rákot genetikailag alig ismerjük. Egyetemünkön a holttestek boncolásának gyakorisága lehetővé teszi, hogy a világon egyedülálló áttéti rák DNS-bankot alakítsunk ki a gyakori daganatféleségek megismerésére. A mintagyűjtés megkezdése óta többszörös melanóma-, tüdőrák- és emlőrák-eseteket sikerült archiválni. A munka során új, vákumos natív minta tárolási eljárást dolgoztunk ki és validáltunk, mely egyhetes intervallumban biztosít szöveti és nukleinsav megőrzöttséget.

Disszeminált daganat kezelése a primer tumor genotípusára alapozva • Emlődaganatok sejtkapcsoló fehérje (klaudin) kifejeződését végeztük primer tumorokban, nyirokcsomó-, illetve szervi metasztázisaikban. Véleményünk szerint a nyirokcsomóáttétek klaudin-1 és -4 expressziója prognosztikus jelentőséggel bírt. A bizonytalan kimenetelű grade 2 differenciáltságú emlődaganatok prognosztikus kilátásainak előrejelzésére génexpressziós mintázatot dolgoztunk ki. A tumoros betegség kimenetelét kromoszómális instabilitást tükröző markerek segítségével jósoljuk meg. A rutin diagnosztikában is használható, a relapszusmentes túlélést magas szignifikanciával előrejelző Klaudin-Cadherin Score-t (CURIO) állítottunk fel, mely a klaudin-4 és az E-cadherin immunhisztokémiával detektálható expressziójának mértékéből képezhető. A CURIO az ösztrogénreceptor-pozitív és a tripla negatív emlőrák alcsoportokban is független prognosztikai faktornak bizonyult a statisztikai elemzés során. A teljes betegcsoportban a magas score rosszabb, az alacsonyabb jobb prognózist jelzett, ám érdekes módon a magas proliferációs aktivitású luminális B csoportban fordított volt az eredmény: a magasabb score-érték jobb, az alacsonyabb rosszabb prognózissal társult (Szász et al., 2011). 387 emlőrákmintát vizsgáltunk szöveti mikrosorozatokban, ahol a sejtciklus-szabályozó fehérjék expresszióját elemeztük (MCM2, geminin, MCM6, H-H3-SP, PLK-1, Cyclin A, Ki67). A Ki67-expresszió mértéke korrelált legjobban a mitózisszámmal, a cyclin A expresszió pedig a DNS-ploiditással. A relapszusmentes túlélést a valamennyi fehérje expressziójából képzett meta-score jelezte, igen magas szignifikanciával (Dr. Kulka Janina).

Emberi veserákok esetében az egyik típusos áttétképzési mód a csontáttét. Primer vesetumorok és csontáttéteik HIF-regulált génexpressziós mintázatát elemeztük RNS- és fehérjeszinten. Prognosztikus értékűnek találtuk a HIF1a, HIF2a, VEGFR2 és EPOR fokozott expresszióját. A veserák-csontáttétekben fokozott, elsősorban a lipidkináz jelpályát érintő EGFR-aktivitást észleltünk, ami újszerű terápiás stratégiák tervezését segítheti elő. Fej-nyaki laphámrákokban a célterápia szempontjából fontos EGFR-génhibákat és expressziós mintázatot elemezve megállapítottuk, hogy az esetek 40%-ában emelkedett kópiaszám és ehhez kapcsoltan vIII deléciós mutáció észlelhető, ami a nyirokcsomóáttétekben is megmarad.

Új lipidomikai módszert teszteltünk hetvenegy emberi vastagbélrák esetében (primer tumor és májáttétek). Az eljárás a szövettani daganat elkülönítéshez hasonló érzékenységgel képes a lipidprofil alapján vastagbélrákszövetet azonosítani. Az eljárás érzékenységére jellemző, hogy lipidomikai alapon a K-RAS-mutáns és vad típusú daganatok is elkülöníthetők, sőt a mutáns csoporton belül ilyen mintázat alapján a 12-es vagy 13-as mutáns kodont hordozó tumorok is elkülöníthetők.

Az emlőrákok kemoterápia iránti érzékenységének predikciója multigénmintázat alapján
(Dr. Kulka Janina)

Létrehoztunk egy integrált adatbázist, amely 2472 emlőrákos beteg túlélési és génexpressziós adatait tartalmazza (22 277 gén). Kaplan–Meier-módszerrel meghatároztuk azon gének csoportját, amelyek a fenti betegekben a túlélés előrejelzésére alkalmazhatóak. A kifejlesztett on-line prediktor már rendelkezésre áll a kutatók számára: www.recurrenceonline.com (Győrffy et al., 2012) (1. ábra). A genetikai emlőrákprediktor eljárások igen költségesek, ezért igyekeztünk minimalizálni a vizsgálandó gének körét, és egy kétgénes, úgynevezett TOP–FOX génpár expressziót dolgoztunk ki (TOPO2A+ FOXM1), mely hasonlóan hatékony: kutatásaink szerint a daganat kromoszóma-instabilitásával függ össze.

Negyvennégy neoadjuvánsan kezelt emlőtumoros beteg mintáiban vizsgáltuk az AURKA- és a gamma-tubulin expressziót. Szignifikánsan magasabb gamma-tubulin expresszió (centrosoma amplifikáció) volt kimutatható a patológiai komplett remissziót mutató betegcsoportban, szemben a részlegesen vagy egyáltalán nem reagáló betegekkel (p=0,03), így hasznos prediktív marker kifejlesztésére nyílik mód.

A tripla-negatív daganatok különösen agresszív molekuláris altípusát képezik az emlőrákoknak, melyet hormonreceptor-negativitás, a HER-2-génhiba hiánya és EGFR-expresszió jellemez. Felmerült bennünk hogy a RAS-jelpálya érintett lehet ebben a daganatféleségben, ezért kilenc tripla-negatív emlőrákban elemeztük a K-RAS-kodon12/13 mutációt. Vizsgálataink szerint az esetek harmadában (3/9) klasszikus kodon12 mutációt észleltünk, amely gyakoriság nagyban hasonlít a vastagbélrákokéhoz. Ezt az eredményünket nagyobb anyagon kívánjuk igazolni, mivel amennyiben ez megerősítést nyer, ez a daganattípus is az EGFR-célterápiák iránti rezisztens csoportot gyarapíthatja (vastagbélrák, tüdőrák, hasnyálmirigyrák).

Molekuláris célpont-azonosítás
primer májrákban
(Dr. Schaff Zsuzsa)

A máj hepatocita eredetű tumoraiban a klaudin-4 sejtkapcsoló fehérje nem expresszálódik, ellentétben az epeút eredetű daganatokkal (Patonai et al., 2011). Az utóbbi, mivel a klostridium perfringens enterotoxin receptora, diagnosztikus tumormarkerként és terápiás célpontként is felhasználható. A klaudin-1-expresszió viszont jelentősen megnövekszik cirózisban és hepatocelluláris karcinómában. Ugyanakkor előzetes eredményeink alapján a klaudin-1 tumorszuppresszorként gátolja a májtumorok növekedését. A hepatocelluláris karcinóma egyik legfontosabb okozója a hepatitis C vírus (HCV). Vizsgálataink során tanulmányoztuk a HCV-fertőzés kialakulásában szerepet játszó receptorok, így a CD81, a scavenger receptor class B1 és a klaudin-1/6 és okludin szerepét a fertőzés krónikussá válásában és összefüggését egyéb sejtkapcsoló struktúrával. A transzplantált humán májakban újra kialakuló HCV-hepatitis megjelenése során a CLDN-1 mRNS- és fehérjeszintje is megnövekedett, ezzel szemben a CD81 fehérjeexpresszió lecsökkent a reinfekció során (Zádori et al., 2011), ami szignifikánsan változott az IFN-kezelés után (2. ábra). Miután a CD81-fehérje csökkenése közben az mRNS-expresszió nem változott, ez felveti a mikroRNS-szabályozás lehetőségét.

2. ábra • HCV-receptorok expressziójának változása HCV-reinfekció IFN-kezelése során májtranszplantált betegekben

A májsejtek mikroRNS készletének 70%-át a MIR-122 mikroRNS alkotja. A MIR-122 kimutatásának beállítását a patológiai diagnosztikai gyakorlatban leggyakrabban használt két mintatípuson, a formalinfixált, paraffinba beágyazott mintákon (FFPE), illetve friss fagyasztott mintákon végeztük. A MIR-122 mind a fagyasztott, mind a paraffinos mintákon detektálható volt 10 ng totál RNS-ből kiindulva. A legkifejezettebb MIR-122-expressziót a normál máj mutatta. A MIR-122 a krónikus hepatitis C vírusfertőzés során csökkent expressziót mutatott a normál májhoz képest. A HCV-rekurrencia során a MIR-99a-expresszió szignifikánsan emelkedett, míg a MIR-33, a MIR-21 és a MIR-194 expressziója szignifikáns csökkenést mutatott a normál májhoz képest. A CLDN-6 mRNS-szint is csökkent a HCV-rekurrencia során.

A továbbiakban a klaudin-1 és a MIR-122, MIR-221, valamint a MIR-96 expresszióját vizsgáltuk a májrák kialakulásában szerepet játszó szteatotikus és nem szteatotikus krónikus HCV-hepatitisben, valamint nem HCV-fertőzött, elzsírosodást mutató és nem mutató májmintákban: 18 HCV+ [1/b genotípus] minta szteatózis nélkül, 28 HCV+ minta szteatózissal; 18 HCV negatív minta, szteatózissal és 6 normál FFPE-minta). A MIR-122- és a MIR-221-expresszió mindegyik csoportban csökkent volt a normál mintákhoz képest. A legkisebb expresszió a HCV-pozitív, nem szteatotikus csoportban volt mérhető, míg a legmagasabb expresszió a HCV-negatív, zsíros degenerációt mutató mintákban volt kimutatható. Összességében tehát a HCV-fertőzés önmagában a szteatózishoz képest emelkedett, de nem szignifikáns MIR-122-expressziót eredményezett. Ezzel ellentétben a MIR-96-expresszió mindegyik csoportban magasabb volt a normál májhoz képest, és a legmagasabb értékeket a zsíros degenerációt mutató (akár HCV-pozitív, akár HCV-negatív) mintákban mértük. Ezen belül a HCV+/szteatózis+ csoport hétszer nagyobb expresz-sziót mutatott a HCV+/szteatózis-negatív csoporthoz képest. Az emelkedett MIR-96-expresszió a vizsgálatok alapján a szteatózisra karakterisztikus marker lehet. A zsíros degenerációval a klaudin-1 expressziója is pozitív korrelációt mutatott. A hepatokarcinogenezis kapcsán észlelt MIR-221-emelkedés ezen csoportokban nem volt észlelhető, ellenkezőleg, csökkent expressziót találtunk a krónikus HCV-hepatitiszben és a szteatózisban. Ez megerősíti azt, hogy a MIR-221 a hepatocelluláris karcinoma markereként lenne felhasználható.

Molekuláris terápiás célpont-keresés
malignus melanomában

A melanómás betegek terápiája drámai változás előtt áll a célzott terápiák korszakának beköszöntével, azonban a betegek egy jelentős csoportjának továbbra is marad a konvencionális citokinterápia (interferon – IFN). Ennek személyre szabott alkalmazását segíti elő, hogy egy 32 génből álló rezisztenciamintázatot határoztunk meg a primer tumorokban, melynek csak 15%-a tartozik a klasszikus IFN-regulált gének közé. Megvizsgáltuk, hogy az IFN-rezisztenciamintázat milyen kapcsolatban áll az áttétképzéssel: 13 génje függetlennek bizonyult, azonban egy hatgénes csoport egyben ún. metasztatikus mintázatot képez: közülük 2 IFN-szabályozott gén. Egy ettől eltérő hétgénes mintázat alkotta az ún. metasztázis-iniciáló génmintázatot (a primer tumorban) és egy négygénes csoport a metasztázis-fenntartó génmintázatot (az áttétekben): mindkét csoportban 2–2 gén az IFN direkt szabályozása alatt áll (Tímár et al., 2010). Mindezen eredmények arra utalnak, hogy a malignus melanóma IFN-rezisztenciája genetikailag az áttétképző képesség kialakulásához kapcsolódó folyamat. A génexpressziós mintázat validálása során fény derült arra, hogy egyes génalkotói (IL13R1 és NID1) a fokozott expresszióval párhuzamosan új hasítási formákban jelentkeznek. Megkezdtük az emberi melanóma metasztatikus mikrokörnyezetének genetikai elemzését, ami során a CCL12 kemokin szerepét igazoltuk.

Genetikai vizsgálataink során a korszerű célterápiák egyik népszerű célpontjának, az EGF-receptornak genetikai eltéréseit elemeztük emberi melanómákban, és azt találtuk, hogy nagy gyakorisággal fejeződnek ki ún. hasítási variánsok és kisebb mutációk, deléciók, melyek valamennyien a ligandkötő extracelluláris szakaszt érintik. Előzetes megfigyeléseink szerint ezek a variánsok is fokozott aktivitáshoz vezetnek, és ezzel potenciális gyógyszercélpontot képezhetnek (3. ábra). In vitro vizsgálataink során kiderült, hogy a parakrin EGF (és a bFGF) elsősorban motogén hatást vált ki emberi melanómasejteken, de ennek feltétele az, hogy a daganatsejtekben az EGFR-jelpálya genetikailag ép legyen (N-RAS és B-RAF vad típusú).

3. ábra • EGFR tirozinkináz-gátló Iressa hatása EGFR-génhibával rendelkező emberi melanóma májáttétképzésére SCID-egérben

Array-vizsgálatok felvetették a CNR1 kannabinoid receptor expresszióját emberi melanómában, melyet sejtvonalakon és emberi melanómákban is igazoltunk, bemutatva a vad típusú gén jelenlétét. A CNR1 szintetikus agonistákkal és antagonistákkal történő modulálásának antiproliferatív, antimigratórikus és proapoptotikus hatása volt, melynek in vivo következménye specifikus antimetasztatikus hatás volt preklinikai modellben. Elemeztük a B-RAF, N-RAS, illetve kettősvad genotípusú melanómák érzékenységét prenilációgátlásra in vitro és in vivo: megállapítottuk, hogy az N-RAS mutáns sejtek rezisztensek, míg a B-RAF sejtek érzékenyek. Ennek klinikai jelentősége az, hogy a jelenleg bevezetett B-RAF-gátló szerek csak a mutáns melanómákon hatnak, és csak átmenetileg, így a prenilációgátlás másodvonalban szóba jöhető opció lehet. Nagyobb beteganyagon elemeztük a B-RAF mutáció hatását a bőr melanómaprogressziója szempontjából, és megállapítottuk, hogy ez a genetikai sajátosság fokozott szervi áttétképző képességgel jár.

A HIF transzkripciós faktor fokozott aktivitása számos daganat progressziós képességének alapja, így a melanómáé is. Újabban fény derült arra, hogy a Zn specifikusan képes felfüggeszteni aktivitását. Vizsgálataink szerint a ZnSO4 in vitro és in vivo körülmények között jelentős szelektív antiproliferatív és antimetasztatikus hatással rendelkezik humán melanóma preklinikai modelljében, amikor a normális sejtek (endothel, fibroblasztok) érzéketlenek.

Célkeresztben
a hematopoetikus rendszer daganatai
(Dr. Matolcsy András)

A krónikus mieloid leukémia (CML) progressziója során kialakuló genetikai léziók kimutatása.
A CML-ben szenvedő betegek közel harmada rezisztenciát mutat a betegség hátterében álló fúziós géntermék- (BCR-ABL) specifikus terápiára, az imatinibre. Munkánk során olyan szekvenáló eljárást állítottunk be, amely specifikus a BCR-ABL-génre és a normál ABL-gént nem amplifikálja, ezáltal alkalmas a mutációk érzékeny kimutatására. Vizsgálataink során közel 160 rezisztens beteg vizsgálatát végeztük, melynek során harmincegy betegben mutattunk ki mutációt. A rezisztencia mutációk tizennégy beteg esetében meghatározták a II. generációs tirozin kináz inhibitor (TKI) terápiát (nilotinib versus dasatinib). Két esetben mutattunk ki teljes TKI-rezisztenciát mutató T315I-mutációt. Tizenhárom esetben mutattuk ki az abl gén 7 exon delécióját, amelynek rezisztenciát okozó hatása a jelen adatok alapján kérdéses. Két esetben mutattuk ki a 8 és 9 exon között 35 bázis inzercióját, mely a BCR-ABL-konformáció változását okozza, amely által nem tud kötődni az imatinib.

B-sejtes non-Hodgkin-limfómák
progressziójában szerepet játszó
genetikai léziók kimutatása

A krónikus limfocitás leukémia (CLL) a betegek 5–30%-ában magasabb malignitású limfómává transzformálódik. Munkánk során CLL-es betegek formalinban fixált paraffinba ágyazott nyirokcsomómintáiban del(11)(q23), del(13)(q14), del(17)(p13) és +12 genetikai eltéréseket mutattunk ki fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) módszerrel. A nyirokcsomók pszeudofollikuluszaiban (PF) szignifikánsan nagyobb arányban fordultak elő kromoszóma-aberrációk a környező interfollikularis területekhez viszonyítva. A genetikai eltérések PF-okban történő felhalmozódása arra utal, hogy a CLL genetikai progressziója és transzformációja feltehetően ezen proliferációs centrumokban kezdődik (Balogh et al., 2011). A progresszió kiindulásának lokalizálása céljából fehérvérsejteket szeparáltunk a CLL által érintett predilekciós helyekről, a nyirokcsomókból, perifériás vérből és csontvelőből. A szeparált tumorsejtekből DNS-t, RNS-t és miRNS-t izoláltunk, majd array-CGH, mátrix-CGH (M-CGH) és teljes génexpressziós array-vizsgálatot végeztünk. Eredményeink alapján a legtöbb genetikai eltérés a perifériás vérben megtalálható tumorsejtekben észlelhető, a legkevesebb viszont a nyirokcsomó malignus sejtjeiben.

A mikrokörnyezet szerepe
a limfómatranszformációban

Harmincöt follikuláris limfómás (húsz csontvelői infiltrációt mutató és tizenöt csontvelői infiltrációt nem mutató) beteg nyirokcsomómintán a reaktív immunsejtekre vonatkozó immunhisztokémiai reakciókat végeztünk. Eredményeink alapján a CD8 pozitív citotoxikus T-limfociták és a CD68-pozitív macrofágok denzitása prognosztikus értékű a csontvelői infiltráció kialakulása tekintetében. Összehasonlító vizsgálatokat is végeztünk a húsz csontvelői manifesztációval rendelkező FL csontvelői és nyirokcsomómintákon a reaktív mikrokörnyezet tekintetében. Szignifikáns különbség volt kimutatható az egyazon beteghez tartozó tumoros nyirokcsomó és csontvelői infiltrátum CD8+ T-sejt, a CD68+ macrofágok, PD1+ helper T- és a FOXP3+ regulator T-sejt tekintetében. Eredményeink összhangban vannak az eddig ismert teóriákkal, miszerint a tumorsejtek importálják magukkal a számukra túlélési szignálokat biztosító reaktív mikrokörnyezetet a csontvelőbe (Rajnai et al., 2012).

A primer csontlimfóma (PBL) ritka betegség, az extranodális limfómák kevesebb mint 5%-át teszi ki. Az esetek kb. 80%-a szövettanilag diffúz, nagy B-sejtes limfómának (DLBCL) felel meg. A prognózis kedvező, a túlélést befolyásoló legfontosabb tényezők az életkor és a betegség stádiuma. A germinativ centrum (GCB) és az aktivált B-sejtes (ABC) eredet a nodális limfómák esetében eltérő prognózist mutat, míg PBL esetében az eddigi vizsgálatok nem találtak összefüggést a túléléssel. Negyvenöt primer csont DLBCL-eset klinikopatológiai elemzését végeztük el. A sejteredet-meghatározási algoritmus alapján a negyvenöt PBDLBCL-es eset közül huszonegy ABC- és huszonnégy GCB-eredetűnek bizonyult. Az

ABC-eredetű csoportban a kezelés tizenhárom betegnél eredményezett komplett remissziót (62%), és hat beteg halt meg egy éven belül, míg a GCB-csoportban tizenkilenc beteg (83%) került komplett remisszióba, és három beteg halt meg – a két csoport túlélése szignifikánsan különbözött. A GCB-csoportban a tumoros mikrokörnyezet szignifikánsan több CD3+ limfocitát tartalmazott, és a CD4/CD8-arány is szignifikánsan magasabbnak bizonyult az ABC-csoporthoz képest, és a CD3+ T-limfociták denzitása is prognosztikusnak bizonyult. Magasabb proliferációs rátát észleltünk a progrediáló esetekben. A komplett remissziót mutató esetekben szignifikánsan több CD3+ T-limfocitát, illetve szignifikánsan több CD8+ cytotoxikus T-limfocitát észleltünk.

Célkeresztben a daganatos beteg:

a molekuláris medicina lehetőségei

Az endoplazmás retikulum lumen redox homeosztázisa: a metabolikus szindróma lehetséges terápiás célpontja
(Dr. Mandl József)

Az endoplazmás retikulum lumenében a citoplazmaitól elkülönült piridin-nukleotid-készlet (NAD(P)-NAD(P)H) található. Ennek redukált állapotát – ami elengedhetetlen a glukokortikoidok prereceptoriális aktivációjához – elsősorban a hexóz-6-foszfát-dehidrogenáz tartja fenn. Mivel az enzim a citoplazmából bejutó glukóz-6-foszfátot használ fel, kulcsszerepet játszik az organellum tápanyagszenzor funkciójában. In vivo kísérleteinben azt találtuk, hogy a táplálékfelvétel nagymértékben befolyásolja az endoplazmás retikulum redox státusát. Ennek megfelelően az organellum kortizoltermelő képessége jóllakott állapotban nő, és éhezésben progresszíven csökken. Bizonyítottuk az enzim „housekeeping” jellegét, ami összhangban van a tápanyagszenzor funkcióval. Bemutattuk hogy a lokális kortizoltermelést ezekben a sejtekben tehát a fruktóz-anyagcsere intermedierjei is serkenthetik, ami részben megmagyarázhatja a fruktóz elhízásban és a diabétesz kialakulásában játszott szerepét. Kimutattuk, hogy az ismert antidiabetikus és elhízásgátló hatással rendelkező epigallokatechin-gallát (EGCG) gátolja a máj mikroszóma kortizoltermelését, és ezt a hatást – a metiraponhoz hasonlóan – nem a részt vevő enzimek gátlása, hanem a luminális [NADPH]:[NADP] arány csökkentése révén fejti ki. A megfigyelés alátámasztja, hogy az endoplazmás retikulum luminális redox homeosztázisa potenciális gyógyszertámadáspont az elhízással kapcsolatos anyagcsere-betegségekben. A zsírsav-deszaturációban és a diabétesz patomechanizmusában fontos szerepet játszó, újonnan azonosított oxidoreduktáz, az Ncb5or természetes humán missense mutációit vizsgálva megállapítottuk, hogy két Glu-Gly cserét okozó mutáció gyorsítja a kódolt fehérje proteaszomális lebontását, és ezáltal csökkenti az enzim féléletidejét. Sejtes és in vivo kísérleti eredményekkel támasztottuk alá a H2O2 fehérje-tioloxidációban betöltött szerepét. Kimutattuk, hogy az EGCG az ER-ben zajló N-glikoziláció gátlása révén egyes fehérjéket a proteaszomális lebontás felé terel, aminek szerepe lehet a katekinek daganatellenes hatásában (Konta et al., 2011). Kiterjedt vizsgálatokat folytattunk a BGP-15 inzulinérzékenyítő, HSP-indukáló molekula hatásainak tisztázására. Kimutattuk, hogy a BGP-15 képes kivédeni egy antipszichotikum, az olanzepin metabolikus mellékhatásait (inzulinrezisztencia, elhízás). Kisérletesen indukált májkárosodásban (acetaminofen) a BGP-15 anti-apoptolikus hatású volt, és ezt a hatását a mitokondriális membrándepolarizáció befolyásolásán keresztül fejtette ki. (Literáti-Nagy et al., 2010)

G-fehérjéhez kapcsolt receptorok
aktivációs modelljeinek elemzése
(Dr. Hunyady László)

A tervezett kutatás elvégzése érdekében olyan módszereket alkalmazunk, illetve fejlesztünk ki, melyek segítségével nyomon tudjuk követni különböző agonista, illetve antagonista vegyületek hatását a receptorok által szabályozott jelátviteli folyamatok működésére. Rezonancia energiatranszferen alapuló módszereket állítunk be, melyek segítségével vizsgálni tudjuk különböző ligandok hatását a receptor b-arresztin kötésére, cAMP- és MAP-kináz aktiváló képességére (Balla et al., 2011). A 2-es típusú vazopresszin receptor (AVPR2) veleszületett funkcióvesztéses mutációja nefrogén diabétesz inszipidusz (nDI) klinikai képét okozza. Kísérleteink célja olyan vazopresszin receptor agonisták azonosítása, melyek képesek egyes betegséget okozó mutáns receptorok aktiválására. A receptor működésének nyomon követése érdekében elkészítettük a vad típusú AVPR2 C-terminálisan fluoreszcens fehérjével (mVenus, corulean), valamint lumineszcens fehérjével (Sluc) jelölt változatait. Mindezen jelölt receptorokkal mérhetővé vált az agonista arginin-vazopresszin kezelés hatására bekövetkező β-arresztin kötődés élő adherens, HEK-293 sejtvonalban (Ligeti et al., 2012). A fentiek mellett szükség van a hormon celluláris jelátvitelének detektálására is. Mindehhez egy holland kutatócsoport által elkészített, és rendelkezésünkre bocsátott cAMP-függő Epac-aktiválódást mérő szondát alkalmazunk, amellyel sejtpopuláció-szinten tudjuk a cAMP-szint változásait detektálni, így a potenciális agonisták hatékonyságát vizsgálni. Kísérleteinkben az intracelluláris cAMP-szint mérésére használt FRET- (fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer) alapú Epac-bioszenzor segítségével nem tudtunk megfelelő jeleket detektálni. Ezért molekuláris biológiai módszerekkel elkészítettük az Epac bioszenzor BRET- (biolumineszcencia rezonancia energiatranszfer) alapú verzióját is, mivel a BRET-módszeren alapuló mérések nagy előnye a FRET-mérésekkel szemben a nagy érzékenység. A Semmelweis Egyetem II. Belgyógyászati Klinikájának munkatársaival (Dr. Tóth Miklós, Dr. Patócs Attila, Prof. Dr. Rácz Károly) együttműködve azonosítottunk egy kongenitális nDI-betegben előforduló missense-mutációt az AVPR2 génjében. A mutáció (N321K) egy aminosav cseréjét okozza a vazopresszin receptorban. Az előzetesen létrehozott bioszenzorok (receptorfúziós fehérjék) mutagenezisével az azonosított mutációt tartalmazó konstruktokat is elkészítettük. Adataink szerint a mutációt tartalmazó receptor fiziológiás koncentrációban adott vazopresszin, illetve a terápiában alkalmazott dezmopresszin hatására nem hozta létre a vad típusú receptorra jellemző cAMP-szint-emelkedést, receptor – β-arresztin kapcsolódást, illetve MAP-kináz aktiválódást. További kísérleteinkben vizsgáljuk, hogy a mutációt tartalmazó receptor milyen egyéb tulajdonságai károsodtak, illetve különböző AVPR2-ligandokat használva keresünk olyan farmakonokat, melyek az N321K-mutációt tartalmazó receptor károsodott funkcióit helyreállítja. Beállítunk HEK293-sejtekből kiindulva egy transzpozonos „Sleeping Beauty” (SB) rendszert, ahol az AVPR2-mVenus DNS-t egy SB-CMV-EGFP-vektorba klónoztuk. Ezek segítségével különböző mutáns receptorokat is tartalmazó sejtvonalakat hozunk létre, és így lehetőség nyílik különböző vegyületek AVPR2-aktiváló hatásának vizsgálatára.

Új metabolikus kutatások és eredményeik felhasználása a központi idegrendszer neurodegeneratív betegségeinek
befolyásolásában
(Dr. Ádám-Vizi Veronika)

Izolált mitokondriumokban kimutattuk, hogy amikor az elektron transzportlánc hibás vagy gátolt, azF80)F(1)ATPase revertál, és a membránpotenciál megtartott mindaddig, amíg a matrix szubsztrát foszforiláció működik, és nem következik be az adenin nukleotid transzlokáz (ANT) reverziója. Ezt a folyamatot igazoltuk tenyésztett neuronokban is, ahol a mitokondriumok légzési láncát blokkoltuk. A jelenséget COS-7-sejtekben és asztrocitákban is kimutattuk. Megfigyeléseink alapján létezik egy védőmechanizmus, amely gátolt sejtlégzés esetében megakadályozza a citoszolikus és magi ATP-depléciót.

Izolált aranyhörcsög-mitokondriumokon kimutattuk, hogy nukleotidok jelenlétében a Ca₂+ által indukált ROS-felszabadulás membránpotenciál-függő: depolarizált mitokondriumok esetében alig indukál a Ca₂+ H₂O₂-felszabdulást. Ugyanakkor erősen polarizált mitokondriumok esetében a Ca₂+ nem indukál mitokondrális ROS-felszabadulást. A jelenség független a mitokondrium membrán-permeabilitás változásaitól. Az alfa-glicerofoszfát dehidrogenáz jelentős szerepet tölt be a citoplazmában képződő NADH oxidálásában. Az enzim egy flavoprotein, mely a mitokondrium belső membrán citoplazma felőli részén helyezkedik el. Az enzimet kalciummal a citoplazma felől aktiválni lehet, és az aktiválást jelentős mennyiségű ROS keletkezése kíséri. A ROS-k részben a Komplex I-en, részben a mátrixban, részben pedig magán az alfa-glicerofoszfát dehidrogenáz enzimen keletkeznek. Eddigi vizsgálataink szerint az enzim Na+-mal való aktivációja fokozza mind a mitokondriális ATP-, mind a mitokondriális ROS-képzést.

A továbbiakban a kalcium szerepét vizsgáltuk a reaktív oxigénszármazék-keletkezésben. Megállapítottuk, hogy az alkalmazott kísérleti körülményektől (alfa-glicerofoszfát-koncentráció, kalciumkoncentrációk) függően a ROS-képzésben három mechanizmus játszik szerepet: a reaktív oxigénszármazékok részben a komplex I-en, részben a mátrixban, részben pedig magán az alfa-glicerofoszfát dehidrogenáz enzimen keletkeznek. Tanulmányoztuk a metilmalonsav hatását a mitokondriális metabolizmusra, és megállapítottuk, hogy gátolja a szukcinát dehidrogenáz enzimet, valamint egy új, a citrát kör sebességmeghatározó lépését aktiváló hatással is bír.

A metil-malonsav (MM) számos katabolikus folyamat közös intermediere, felhalmozódása azonban súlyos, idegrendszeri tünetekkel is járó kórkép okozója. A betegségben a mitokondriumok diszfunkciójára utaló jelek is megfigyelhetők. Megállapítottuk (az irodalmi adatokkal összhangban), hogy a MM gátolja a szukcinát oxidációját, a gátlás kompetitív jellegű. Érdekes, új megfigyelésünk, hogy a MM hatására az alfa-ketoglutarát (a-KG) oxidációja szignifikánsan fokozódik. A MM oxidációt fokozó hatása tükröződik az ATP-termelés fokozódásában és a DYm hiperpolarizációjában is. A jelenséget magyarázhatja, hogy i) a MM fokozza az a-KG mitokondriális transzportját, ii) a mitokondriumokhoz adott MM maga is aktiválódik, és oxidálódik, iii) a MM fokozza az a-KGDHc aktivitását. Eredményeinket úgy interpretáljuk, hogy a MM hatására legvalószínűbben az a-KG mitokondriális transzportja aktiválódik, de nem zárható ki a szukcinil-CoA – acetacetát transzferreakció analógiájára a szukcinil-CoA – metilmalonil-CoA transzfer lehetősége sem. Eredményeink arra utalnak, hogy az extracelluláris MM csak lassan jut be a sejtekbe, és a sejtkárosodást az intracellulárisan termelődő és nem a keringéssel transzportálódó MM okozza.

Elemeztük a dihidrolipoamid dehidrogenáz (LADH) patogén mutációinak funkcionális következményeit expressziós vektorban. Négy mutáció az LADH enzimaktivitásának csökkenésével, de ROS-generáló képességének fokozódásával járt. A genetikai változások nem eredményeztek konformációs eltéréseket. Az emberi LADH-hiányos betegségekben az antioxidáns terápia racionális megközelítés lehet (Ambrus et al., 2011).

A ciclofilin-D- (CD) hiányos egerek rezisztensek a fokális agyi isémiára és nekrózisra, de érzékenyek maradnak apoptózisra. A jelenséget agyszövetben, illetve izolált neuron és asztrocita mitokondriumokon elemeztük. A Ca₂+ CD-függő módon indukált mitokondriális duzzadást, melyet complex I gátlás felfüggesztett. Asztrocitában, illetve neuronokban a CD eltérően vett részt a mitokondriális duzzadásban. Neuronokban a CD-hiányos mitokondriumok glutamátindukált duzzadása késleltetett volt. Ezen megfigyelések azt igazolják, hogy bizonyos körülmények között a CD véd agyi nekrózis kialakulása ellen (Doczi et al., 2011).

Mikrovezikulum mint új terápiás
támadáspont a szepszis kezelésében
(Dr. Ligeti Erzsébet)

Kimutattuk, hogy izolált neutrofil granulociták különböző stimulusok hatására mikrovezikulumokat képeznek, amelyek bizonyos körülmények között baktériumok növekedését képesek gátolni. Összehasonlítottuk az antibaktériális hatással rendelkező, valamint az antibaktériális hatást nem mutató mikrovezikulumokat. Áramlási citométerben nem találtunk különbséget a méret és granuláltság tekintetében. Az antibakteriális hatást mutató és azzal nem rendelkező mikrovezikula populáción proteomikai elemzést végeztünk. Mindegyik preparátumban 90 fehérjét sikerült 98%-os biztonsággal azonosítani: ezek között a legnagyobb mennyiségben antibakteriális fehérjéket, felszíni adhéziós proteineket, metabolikus enzimeket, valamint a citoszkeleton alkotórészeit találtuk. A proteomikai analízis sem HLA-antigéneket, sem NADPH oxidáz komponenseket nem talált. Ezen vizsgálatok alapján kimondhatjuk, hogy az általunk felfedezett mikrovezikulumok nemoxidatív mechanizmussal gátolják a baktériumok szaporodását. Kimutattuk, hogy glukóz hiányában elvész ezen mikrovezikulumok baktériumnövekedést gátló hatása. Részletesen megvizsgáltuk a proteomikai analízis eredményeit, és azt tapasztaltuk, hogy az antibakteriális hatással rendelkező mikrovezikulumokban számos, eredetileg neutrofil granulumban elhelyezkedő protein bedúsult. Megállapítottuk, hogy az antibaktériális hatással rendelkező vezikulákban legalább 50%-os dúsulást tapasztaltunk 29 fehérje esetében. Ezek közül 26 fehérje a neutrofil granulociták különböző granulum-populációinak ismert összetevője (például lactoferritin és myeloperoxidase, 4. ábra), tehát opszonizált részecske fagocitózisa során a keletkező mikrovezikulumokba halmozottan jutnak be a granulumok (Csépányi-Kömi et al., 2011). A proteomikai elemzés eredményét sikerült immunblottal megerősíteni a laktoferrin, valamint a mieloperoxidáz esetében. Immun-fluoreszcens vizsgálatokat végeztünk a granulumfehérjék vezikulán belüli lokalizációjának kimutatására. Nyugvó vezikulumban a mieloperoxidáz enzim csak a vezikula permeabilizálását követően festődik, tehát egyértelműen a vezikula belsejében helyezkedik el. A mikrovezikulumok eltarthatóságának vizsgálatában kimutattuk, hogy egy hétig -20 oC-on történő tárolás – amit az exoszomák esetében más munkacsoportok kiterjedten alkalmaznak – az antibakteriális hatás elvesztését eredményezi. Az antibakteriális hatás specificitásának igazolására kimutattuk, hogy a kontroll vezikulumok számának növelésével nem lehetséges antibakteriális hatást elérni. A mikrovezikulumok gátolják az S. aureus és az E. coli növekedését, de nem hatásosak például a P. mirabilis ellen, antibakteriális hatásuk tehát bizonyos szelektivitást mutat.

4. ábra • Antibakteriális mikrovezikulumok (b-MV) lactoferritin- és myeloperoxidase-tartalma

Eredmények számokban

A kutatásokban tizenhárom főállású és huszonhárom részfoglalkozású kutató vett részt, tizenhárom új PhD-hallgató mellett. A kutatási eredményekről hatvanhat nemzetközi közlemény és harminchárom nemzetközi konferencia előadása ad számot, míg ezekből két szabadalom is született.

A résztvevők bemutatása

A Semmelweis Egyetem II. számú Patológiai Intézete az ország egyik meghatározó patológiai intézménye. Vezetője Dr. Tímár József, az MTA doktora. Hazai referenciaközpont az emlőrákok, a gasztrointesztinális- és urogenitális-, tüdő- és májdaganatok terén. Fő kutatási területek: a daganatok ereződése és az áttétképzés genetikája (vezetője Dr. Tímár József), a hepatokarcinogenezis (vezetője Dr. Schaff Zsuzsa akadémikus) és az emlőrák molekuláris patológiája (vezetője Dr. Kulka Janina egyetemi tanár). Közös kutatásokat végez az Semmelweis Egyetem I. számú Gyermekgyó-gyászati Klinika MTA-kutatócsoportjával (Dr. Győrffy Balázs). Ezen kutatásokat három MTA doktori, kilenc PhD-fokozattal rendelkező kutató és hét PhD-hallgató végzi.

A Semmelweis Egyetem I. számú Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézete tíz éve tölti be a Magyarországi Onkohematológiai Centrum szerepét, vezetője Dr. Matolcsy András, az MTA doktora. Az onkohematológiai diagnosztikát az intézet „komplex” módon, morfológiai, citogenetikai, áramláscitometriai, és molekuláris módszerekkel végzi. Az onkohematológiai diagnosztikát mintegy tizenöt munkatárs, köztük három minősített orvos, három minősített biológus és kilenc technikus végzi. A munkacsoportot akadémiai doktor, egyetemi tanár vezeti. Az onkohematológiai munkacsoport egyik legfőbb feladata a hematológiai diagnosztika folyamatos fejlesztése, és a fejlesztések bevezetése a mindennapi rutin diagnosztikába.

A Semmelweis Egyetem Orvosi Biokémiai Intézet 1996-ban kapta jelenlegi elnevezését. Az intézetet hagyományai a metabolikus, az idegrendszeri és a hemosztázis kutatásokhoz kötik. Az intézet igazgatója 1990-től Ádám Veronika, az MTA rendes tagja. Irányítása alatt vált a neurobiokémia az intézet meghatározó profiljává, és szintén ő a vezetője az intézetben működő MTA Neurobiokémiai kutatócsoportjának is. A Neurokémiai munkacsoport vizsgálja a neurodegenerációban és stroke-ban szerepet játszó bioenergetikai folyamatokat.

A Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézet vezetője Dr. Mandl József, az MTA tagja. Az intézetben működő munkacsoportok többek között a metabolikus szindróma különböző aspektusait vizsgálják, így az endoplazmás retikulum stressz, a humán genetikai polimorfizmusok szerepét, a chaperonok működését, a kinázgátló vegyületek lehetséges alkalmazását; emellett nagyobb, hálózatkutatással és tirozin kinázokkal foglalkozó munkacsoportok is működnek. Az intézet kutatói a közelmúltban két magyar fejlesztésű molekula sikeres, klinikai fázis-II vizsgálatának előkészítésében vettek részt. Az ER-stressz befolyásolásával, illetve kinázgátló molekulák hatásvizsgálatával preklinikai vizsgálatokat végeznek cukorbetegség-ellenes szerek kutatásában. Több EU-pályázatban – köztük két nanotechnológiai – pályázatban vesznek részt intézeti kutatók.

A Semmelweis Egyetem Élettani Intézetében nemzetközi szinten is elismert kutatási és fejlesztési tevékenység folyik. Az intézet vezetője Dr. Hunyady László, az MTA levelező tagja. A hazai pályázati források mellett az intézet kutatói olyan jelentős nemzetközi támogatásokat nyertek el, mint a European Research Council, a Wellcome Trust, a Howard Hughes Medical Institute, illetve az MTA Lendület programjának támogatása, és az elmúlt években több sikeres NKTH által támogatott fejlesztési projekt is megvalósult. Az intézet több EU-pályázat megvalósításában vesz részt, melyek közül közül a Tarkinaid projektben a konzorcium vezetője Dr. Mócsai Attila, az Élettani Intézet egyetemi docense. Dr. Hunyady László akadémikus a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok kutatásának nemzetközileg elismert képviselője. Dr. Ligeti Erzsébet akadémikus munkacsoportja a kis G-fehérjék és ezek működését szabályozó elemeket kutatja, illetve vizsgálják a NADPH-oxidáz enzim szerepét az immunvédekezésben.
 

Kulcsszavak: molekuláris terápia, daganat, gazdaszervezet
 

IRODALOM

Ambrus A. – Törőcsik B. – Tretter L. – Ozohanics O. – Ádám-Vizi V. (2011): Stimulation of Reactive Oxygen Species Generation by Disease-Causing Mutations of Lipoamide Dehydrogenase. Human Molecular Genetics. 20, 2984–2995.

Balla A. – Erdélyi L. S. – Soltész-Katona E. – Balla T. – Várnai P. – Hunyady L. (2011): Demonstration of Angiotensin II-induced Ras Activation in the Trans-Golgi Network and Endoplasmic Reticulum Using Bioluminescence Resonace Energy Transfer-Based Biosensors. Journal of Biological Chemistry. 286, 5319–5327.

Balogh Zs. – Reiniger L. – Rajnai H. – Csomor J. – Szepesi Á. – Balogh A. – Deák L. – Gagyi É. – Bödör Cs. – Matolcsy A. (2011): High Rate of Neoplastic Cells with Genetic Abnormalities in Proliferation Centers of Chronic Lymphocytic Leukemia. Leukemia & Lymphoma. 52, 1080–1084.

Csépányi-Kömi R. – Sirokmány G. – Geiszt M. – Ligeti E. (2011): ARHGAP25, A Novel Rac GTPase Activating Protein Regulates Phagocytosis in Human Neutrophilic Granulocytes. Blood. 119, 573–582.

Doczi J. – Turiak L. – Vajda S. – Mandi M. – Torocsik B. – Gerencser A. A . – Kiss G. – Konrad C. – Adam-Vizi V. – Chinopoulos, C. (2011): Complex Contribution of Cyclophilin D to Ca2+-Induced Permeability Transition in Brain Mitochondria, with Relation to the Bioenergetic State. Journal of Biological Chemistry. 286, 6345–6353.

Győrffy B. – Benke Zs. – Lánczky A. – Balázs B. – Szállási Z. – Tímár J. – Schäfer R. (2012): Recurrence Online: an online analysis tool to determine breast cancer recurrence and hormone receptor status using microarray data. Breast Cancer Research Treatment. (epub)

Konta L. – Száraz P. – Magyar J. E. – Révész K. – Bánhegyi G. – Mandl J. – Csala M. (2011): Inhibition of Glycoprotein Synthesis in the Endoplasmic Reticulum as a Novel Anticancer Mechanism of (-)-Epigallocatechin-3-gallate. Biofactors. 37, 468–476,

Ligeti E. – Welti S. – Scheffzek K. (2012): Inhibition and Termination of Physiological Responses by GTPase Activating Proteins. Physiological Reviews. 92, 237–272.

Literáti-Nagy B. – Péterfai E. – Kulcsár E. – Literáti-Nagy Z. – Buday B. – Tory, K. – Mandl J. – Sümegi B. – Fleming, A. – Roth J. – Korányi L. (2010): Beneficial Effect of the Insulin Sensitizer (HSP Inducer) Bgp-15 on Olanzapine-induced Metabolic Disorders. Brain Research Bulletin. 83, 340–344.

Patonai A. – Erdélyi-Belle B. – Korompay A. – Somorácz A. – Straub B. K. – Schirmacher P. – Kovalszky I. – Lotz G. – Kiss A. – Schaff Zs. (2011): Claudins and Tricellulin in Fibrolamellar Hepatocellular Carcinoma. Virchows Archiv. 458, 679–688.

Rajnai H. – Bödör Cs. – Balogh Z. – Gagyi E. – Csomor J. – Krenács T. – Tóth E. – Matolcsy A. (2012): Impact of the Reactive Microenvironment on the Bone Marrow Involvement of Follicular Lymphoma. Histopathology. (epub)

Szász A. M. et al. (2011): Identification of a Claudin-4 and E-cadherin Score to Predict Prognosis in Breast Cancer. Cancer Science. 102, 12, 2248–2254.

Tímár J. – Győrffy B. – Rásó E. (2010): Gene Signature of the Metastatic Potential of Cutaneous Melanoma. Clinical & Experimental Metastasis. 27, 371–387.

Zádori G. – Gelley F. – Törzsök P. – Sárváry E. – Doros A. – Deák A. P. – Nagy P. – Schaff Zs. – Kiss A. – Nemes B. (2011): Examination of Claudin-1 Expression in Patients Undergoing Liver Transplantation Owing to Hepatitis C Virus Cirrhosis. Transplantation Proceedings. 43: 1267–1271.