A földi élőlények felépítésében az aszimmetrikus molekulák kulcsszerepet játszanak. Például a legfontosabb biológiai építőelemek közül való aminosavak többsége két térbeli szerkezetet vehet fel, amelyek tükörképi párjai egymásnak csakúgy, mint a jobb és bal kezünk (1. ábra). Az ilyen aszimmetrikus molekulákat királisnak, a tükörképi viszonyban álló molekulákat enantiomereknek nevezzük. A biomolekulák felépítésében néhány kivételtől eltekintve csak egyetlen enantiomer vesz részt: a fehérjéket csak balkezes aminosavak alkotják. Ezt a jelenséget hívjuk biológiai homokiralitásnak (Pályi, 1999).

1. ábra • A természetes α-aminosavak lehetséges két térbeli konfigurációja az aszimmetrikus szénatom körül. A bal- és a jobbkezes elrendeződést rendre S és R jelöli, követve a standard kémiai nómenklatúrát.

Mivel a tükörképi párok valamennyi akirális közegben vizsgált fizikai és kémiai tulajdonsága megegyezik, a biológai homokiralitás nem magától értetődő jelenség. Már Louis Pasteur megfogalmazta, hogy az enantiomerek feldúsulása általában az élet jelenlétéről tanúskodik. Nagyon valószínű, hogy a homokiralitás és az élet eredetét közös ponton kell keresnünk, és bár számos hipotézist találhatunk erre vonatkozóan az irodalomban (Meierhenrich, 2008; Carrol, 2009), konszenzusra vezető elmélet jelenleg sincs. Az egyik alapvető kérdés ebben a vonatkozásban, hogy a homokiralitás szükséges előfeltétele-e az életért felelős makromolekulák kialakulásának, vagy csupán egy véletlen, az élet kialakulásával párhuzamos folyamat eredménye.

De miért fontos az építőelemek homokiralitása a makromolekulák létrejöttében és működésében? A biopolimerek funkciója szorosan összefügg a térbeli szerkezetükkel, és ez a térszerkezet jobbára önrendeződő módon alakul ki. Fehérjék esetén a feltekeredés módja az aminosavsorrendben van kódolva, s ezt információt a DNS tartalmazza. A genetikai kód nem terjed ki az aminosav-építőelemek kiralitására, implicite feltételezi a térbeliség állandóságát. A balkezes aminosavak kiválasztása már a riboszomális fehérjeszintézis magasabb szintjén történik. Az enantiomerek véletlen sorrendű beépülése a fehérjékbe a funkcióért felelős jól definiált térszerkezetek hiányát eredményezné, ami kizárja az életet. Emellett az evolúció alanyába, a DNS-fehérjerendszerbe egy rejtett, statisztikus paraméter is belekerülne, ami lehetetlenné tenné az előnyös tulajdonságok szisztematikus átörökítését.

Kivételeket találunk azonban a természetben arra, hogy a balkezes és jobbkezes építőelemeket együttesen tartalmazó biopolimerek rendezett és esetenként funkcióval rendelkező térszerkezetet vesznek fel. Erre jó példa a gramicidin S antibiotikum ún. β-hélixe (2. ábra) amelyet a Bacillus brevis baktérium termel, természetesen nem riboszómális fehérjeszintézis útján. Ebben az esetben az α-aminosavak tükörképi párjai szisztematikusan felváltva épülnek be a láncba, így a szerkezet már nem homokirális, mégis képes az aminosavak sorrend által kódolt helikális önrendeződésére. Mesterségesen előállított α-peptideknél az építőelemek térkémiájának sorrendjét tetszőlegesen megválaszthatjuk, és ilyen esetekben is számíthatunk az önrendeződésre (Rana et al., 2005).

2. ábra • A gramicidin bakteriális eredetű peptid által létrehozott helikális szerkezet (β-hélix). Ez a szerkezet a sejtmembrán közegében alakul ki.

Látható, hogy a homokiralitás az önrendeződés feltételeként való előírása túlságosan szigorú kritérium, ugyanakkor a véletlenszerű beépülés is kizárható. Meddig lazítható vajon a homokiralitási feltétel? Meg kell állnunk az alternáló heterokirális láncoknál, vagy létezik egy általánosabb szabály? A kérdéseink megválaszolásához vizsgáljuk meg, mi adja a fő hajtóerőt a polipeptidek önrendeződéséhez. Elsősorban a láncban lévő peptidcsoportok (CONH) közötti elektrosztatikus vonzás biztosítja az energianyereséget, ahol a két kölcsönható csoportnak közel párhuzamos orientációjúnak kell lennie: CONH — CONH. A peptidcsoportok gerinchez képest felvett irányát a φ és ψ torziós szögekkel írjuk le (Ramachandran- és Balaram-definíciók szerint, 3. ábra). Ilyenkor térben közel kerülhetnek a csoportok ellentétes töltései. A peptidkötések orientációját azonban a láncban velük szomszédos kiralitáscentrumok, az aszimmetrikus szénatomok térbelisége határozza meg.

3. ábra • Az α- és a β-peptidek kémiai szerkezetének összehasonlítása. Feltüntettük a peptidkötések orientációját leíró torziós szögeket. A β-peptidek esetén a két aszimmetrikus szénatom közötti torzió szintén befolyással van a szerkezetre, de ez nem független a φ és ψ torzióktól, és magyarázata túlmutat a jelen közlemény keretein.

Mivel az α-peptidek esetében egy kiralitás­centrum két peptidkötés irányára hat egyidejűleg (3. ábra), a természetes peptidek/fehérjék ebből a szempontból speciális esetnek számítanak. A térbeli konfigurációk és a peptidcsoportok iránya közötti összefüggést olyan rendszereken könnyebb vizsgálni, ahol egy centrum csak egyetlen peptidcsoport-irányra van befolyással. A legegyszerűbb ilyen építőelemek a β-aminosavak. Amíg az α-peptidek egyetlen aszimmetrikus szénatomot tartalmaznak a peptidcsoportok között, a β-peptidekben két potenciálisan aszimmetrikus szénatom található. Ez négyre emeli a lehetséges térbeli konfigurációk számát. A látszólag megnövekedett flexibilitás ellenére, a β-peptidek igen változatos másodlagos szerkezeti mintázatokat tudnak létrehozni már igen rövid lánchosszon. Az eddig ismert β-peptid hélixek már hexamer hosszúságban is nagy stabilitást mutatnak, és a peptidáz enzimek nem emésztik (Goodman et al., 2007). Ugyanúgy, mint a proteineknél, a másodlagos szerkezetek között megtalálhatjuk a hélix és szál alaptípusokat. Homokirális építőelemekből többféle hélixet lehet előállítani. A hélixeket az őket stabilizáló hidrogénkötéses gyűrű tagszáma alapján nevezzük el, így léteznek például a H10, H12, H14 típusok (Martinek – Fülöp, 2003). A β-peptidek körében is megtaláljuk az alternáló heterokirális láncokat, melyek a természetes gramicidin β-hélixével rokon, ún. H10/12 hélixet, valamint a fehérjealkotó β-szálakhoz hasonló nem poláris szálakat hozzák létre (4. ábra) (Martinek et al., 2006). A β-aminosavak kombinálhatók a természetes α-aminosavakkal is, és így további változatos struktúrák hozhatók létre. Ezek az önrendeződő peptidomimetikumok egy lényegesen szélesebb körű mintát biztosítanak a térkémiai összefüggések felderítéséhez.

Mivel a gerincatomok konfigurációja a torziós szögeken keresztül fejtik ki hatásukat, előbb megvizsgáltuk, hogy milyen kapcsolat van a kérdéses torziók (φ és ψ) mintázata és a másodlagos szerkezet típusa között, majd korrelációt próbáltunk találni a jobbkezes és balkezes aszimmetria-centrumok sorrendje (az abszolút konfiguráció) és a másodlagos szerkezetekben mért torziós szögek között. Az irodalmi és saját adataink elemzésével az alábbi megfigyeléseket tettük (1. táblázat).

1. Hélixek esetében a peptidkötések két oldalán csak azonos előjelű ψ és φ torziók fordulhatnak elő: +][+ vagy -][-, ahol a ’][’ szimbólum a CONH peptidkötést jelenti. A szál-típusú szerkezeteknél eltérő előjelű szögek vannak: +][- vagy -][+.

2. Hélixeknél a torziós szögek előjelei meghatározzák a peptidkötés orientációját a gerinc standard irányítottságához (N-vég → C-vég) képest. Az irány függ attól is, hogy a hélix jobb- (P) vagy balmenetes (M).

3. Mivel a peptidláncok önrendeződésének feltétele az amidcsoportok közötti (intra)molekuláris felismerés, a kölcsönhatásban lévő szakaszoknál a peptidkötések orientációjának illeszkedőnek kell lennie. Ez megköveteli a gerinctorziók megfelelő mintázatát, amit azonban csak megfelelő sztereokémiai mintázat hozhat létre. Összegezve kimondhatjuk, hogy a hélixek és redőzött rétegek kialakulásához valóban nem szükséges a homokiralitás. A szükséges feltétel az ismétlődő térkémiai mintázat jelenléte.

4. A proteinek és α-peptidek körében jól ismert a Rachandran-féle összefüggés. Ennek folyománya, hogy a balkezes szénatom kizárólag negatív előjelű (-]) φ torziót tesz lehetővé a stabilis másodlagos szerkezeteknél. A ψ szögre a sztereokémia kisebb strukturáló hatással van, mivel az felvehet pozitív ([+) és negatív ([-) szögeket is. Ez utóbbi valójában az α-aminosavak fent említett speciális voltából fakad. β-peptidek esetében mindkét királis szénatom erősen strukturál, és hatásuk elkülönítetten jelentkezik: balkezes konfiguráció esetén csak negatív előjelű torziós szögeket tesznek lehetővé mind a ψ, mind a φ torzióknál. A jobbkezes konfiguráció pozitív torziókat eredményez.

Hogy megvizsgáljuk ezeknek a szabályoknak az érvényességét és prediktív erejét, két különböző típusú de novo szekvenciát terveztünk (1–3), melyek úgy teljesítik a fenti szabályokat, hogy a várt szerkezetük helikális (5. ábra). A tervezésnél alkalmaztuk a hélixet indukáló azonos előjelű torziók és a periodikus sztereokémiai mintázat elvét, és az általánosság kedvéért az α- és β-aminosavakat kombináltunk. Létrehoztunk olyan negatív kontroll-láncokat is, ahol a konfigurációkat felcseréltük (4–6).

A tervezett és kontrollpeptideket szilárd hordozón, Fmoc kémiával szintetizáltuk meg, és HPLC-vel tisztítottuk. Az anyagokat deuterált dimetil-szulfoxidban, metanolban és vízben jellemeztük. A minták jelfeloldottsága jó volt, a NMR-jelek hozzárendelését a 2D homonukleáris korrelációs spektrumok segítségével végeztük el. A peptidkötések árnyékolására jellemző kémiai eltolódás-hőmérsékleti koefficiensek jól jelezték a stabilizáló hidrogénkötéseket. A nagyfelbontású szerkezetmeghatározást a távolható keresztrelaxációs kölcsönhatások (ROESY – ROtating frame nuclear Overhauser Effect SpectroscopY) segítségével végeztük el, ahol a térközelben lévő hidrogénatomok mutathatók ki. A tervezett szekvenciáknál egyértelműen láthatók a helikális szerkezetekre jellemző kölcsönhatások. A kontrollszekvenciáknál efféle periodikus szerkezetekre jellemző jeleket nem találtunk. A modellezést molekuláris mechanikai szinten kényszerfeltétel nélküli mintavételezéssel kezdtük meg. Itt a legalacsonyabb energiájú konformációs családok egyértelműen mutatták a várt helikális rendeződéseket. Az egyik szekvenciánál komplex, 9–10–11–12-tagú, egymásba fűzött H-kötéses gyűrűk stabilizálják a hélixet, és a peptidkötések alternáló orientációt mutattak. A másik modellünknél egy H14/16 típusú hélixet kaptunk, ahol a peptidorientáció (parallel–antiparallel–antiparallel)n mintázatot adott. Ilyen hélixeket eleddig nem találtak. A kontrollszekvenciák nem mutattak helikális rendeződést. A helikális konformáció detektálására elektronikus cirkuláris dichroizmus (ECD-) spektroszkópiát alkalmaztunk. Mindkét hélix esetében Cotton-effektust figyelhettünk meg. A H14/16 kontrollszekvenciája nem mutatott ECD-aktivitást, míg a H9-12 kontrollminta a helikálistól teljesen eltérő ECD-mintázatot mutatott. A tervezett helikális mintáknál az ECD-jelek csökkent intenzitással vízben is megtartották a jellegüket, ugyanakkor a kontrollpeptidek elvesztették szerkezetüket ebben az oldószerben. Ezek a megfigyelések alátámasztják, hogy a tervezett struktúrák a szerkezet kellően stabilisak, a későbbiekben a vizes közegű biológiai alkalmazások szóba kerülhetnek.

6. ábra • Az 1 (a) és 3 (b) peptidláncok helikális szerkezetei. A geometriák igazolását oldatfázisban NMR- és cirkuláris dichroizmus spektroszkópiák, valamint molekulamodel-lezés segítségével végeztük el.

A természetes α-aminosavakból felépülő proteinek/peptidek és a mesterséges β-peptidek másodlagos szerkezeteinek átfogó vizsgálatával felismertük, hogy a gerinc szénatomok térkémiája és a hozzájuk kapcsolódó torziós szögek között általánosítható összefüggés áll fenn. Továbbá felfigyeltünk a torziós szögek előjelének mintázata és a másodlagos szerkezet közötti kapcsolatra is. Az összefüggések jól használható eszközt adnak a térkémia másodlagos szerkezetre gyakorolt hatásának megértéséhez. A szabályok prediktíveknek bizonyultak, mivel a segítségükkel új hélixeket tudtunk tervezni, amelyek stabilisnak mutatkoztak oldatfázisban (Mándity et al., 2009). Az eredményeink alátámasztják, hogy a polipeptid láncok önrendeződéséhez nem szükséges a homokiralitás; elegendő az említett szabályok szerinti periodikus térkémia jelenléte. A mintázati megközelítés rámutatott arra is, hogy a torziók előjele, illetve az ezt befolyásoló abszolút konfigurációk egyfajta bináris kódot alkotnak, amelyek a másodlagos szerkezet alaptípusát és több tulajdonságát képesek meghatározni. Ebben az összefüggésben ezt egy szoftvernek foghatjuk fel, ami a peptidláncon mint hardveren „végrehajtódva” a másodlagos szerkezetet adja kimenetként. Úgy véljük, hogy a bemutatott módszer utat nyithat újabb hélixtípusok létrehozásához, amelyek a jövőben a gyógyszerkutatás területén nyerhetnek alkalmazást (Kritzer et al., 2005).
 

Köszönettel tartozom az OTKA (NF69316) anyagi támogatásáért. Köszönöm a külső partnereknek (prof. dr. Tóth Gábor, dr. Fülöp Lívia, dr. Hetényi Anasztázia [SZTE Orvosi Vegytani Intézet]; Prof. dr. Hollósi Miklós, dr. Vass Elemér [ELTE Kémiai Intézet]), és munkatársaimnak (Mándity István, Wéber Edit és Szolnoki Éva) az együttműködést és a segítséget. Köszönet illeti mentoromat, prof. dr. Fülöp Ferenc akadémikust.
 

Kulcsszavak: peptidomimetikum, sztereokémia, aminosavak, β-aminosavak, β-peptidek, konformáció, NMR-spektroszkópia, cirkuláris dichroizmus
 

IRODALOM

Carroll, James D. (2009): A New Definition of Life. Chirality. 21, 3, 354–358. http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/fulltext/120082041/PDFSTART

Goodman, Catherine M. – Choi, S. - Shandler, S. - DeGrado, W. F. (2007): Foldamers as Versatile Frameworks for the Design and Evolution of Function. Nature Chemical Biology. 3, 252–262.

Kritzer, Joshua A. – Luedtke, N. W. – Harker, E. A. – Schepartz, A. (2005): A Rapid Library Screen for Tailoring Beta-Peptide Structure and Function. Journal of the American Chemical Society. 127, 14584–14585 (például).

Martinek Tamás A. – Fülöp Ferenc (2003): Side-chain Control of Beta-peptide Secondary Structures. European Journal of Biochemistry. 270, 3657–3666.

Martinek Tamás A. – Mándity I. M. – Fülöp L. – Tóth G. K. – Vass E. – Hollósi M. – Forró E. – Fülöp F. (2006): Effects of the Alternating Backbone Configuration on the Secondary Structure and Self-Assembly of beta-Peptides. Journal of the American Chemical Society. 128, 13539–13544.

Martinek Tamás A. – Hetényi, A. – Fülöp, L. – Mándity, I. M. – Tóth, G. K. – Dékány, I. – Fülöp, F. (2006): Secondary Structure Dependent Self-Assembly of b-Peptides into Nanosized Fibrils and Membranes. Angewandte Chemie International Edition. 45, 2396–2400.

Mándity István M. – Wéber E. – Martinek T. A. – Olajos G. – Tóth G.K. – Vass E. – Fülöp F. (2009): Design of Peptidic Foldamer Helices: A Stereo­chemical Patterning Approach. Angewandte Chemie International Edition. 48, 2171–2175.

Meierhenrich, Uwe (2008): Amino Acids and the Asymmetry of Life, Caught in the Act of Formation. Springer

Pályi Gyula – Zucchi C. – Caglioti L. (eds.) (1999): Advances in BioChirality. Elsevier Science, Amsterdam

Rana, Soumendra – Kundub, B. – Durani, S. (2005): A Small Peptide Stereochemically Customized as a Globular Fold with a Molecular Cleft. Chemical Communications. 207–209. WEBCÍM >