Az élő szervezetek működésében meghatározó szerepet játszanak a sejtekben található dinamikus fehérjerendszerek, amelyek azok szerkezeti és funkcionális vázát biztosítják. Ennek egyik nélkülözhetetlen eleme az aktin sejtváz vagy aktin citoszkeleton. Az aktin citoszkeleton esszenciális szerepet játszik szinte minden sejtfolyamatban. Meghatározó a változatos sejtfunkciók kialakításában, azok pontos térbeli és időbeli szabályozásában és összehangolásában. Az aktin sejtváz alapvető alkotóeleme az aktinfehérje. Az aktin a sejtben két formában fordulhat elő; globuláris monomerként vagy az ezekből kialakuló szálszerű filamentumként (Bugyi – Carlier, 2010). A monomerek spontán módon is filamentumokba szerveződhetnek, ezt polimerizációnak nevezzük. A folyamat első szakasza, a nukleáció során két, ill. három monomer összekapcsolódása révén nukleációs magocskák alakulnak ki. Ezek további monomerek hozzákapcsolódása következtében növekednek (elongáció), így létrejönnek a filamentumok. A spontán polimerizáció viszonylag lassú folyamat a nukleációs magok instabilitása miatt, így egy filamentum kialakulása akár órákat is igénybe vehet. Gondoljuk meg, hogy ez a sejt működése szempontjából nem szerencsés, egyrészt a sejt „óráját” tekintve rendkívül lassú, másrészt térben és időben szabályozatlan, anarchikus filamentum képződéshez vezetne. Hogyan képes a sejt ezt a folyamatot felgyorsítani, azaz katalizálni, valamint szabályozni? Miként tudnak ezek az „egyszerű” aktinszálak változatos funkciókat létrehozni? Ezek a kérdések az aktin szabályozó fehérjéinek színes világához vezetnek minket, amelyek az aktin sejtváz működésének finomhangolását végzik.

A sejtben az aktin filamentumok polimerizációjának szabályozásáért apró molekuláris fehérjegépezetek, az úgynevezett összeszerelő faktorok felelősek (Bugyi – Carlier, 2010). Ezek közé tartozik a formin fehérjecsalád is. A forminfehérjék széles taxonómiai eloszlást mutatnak, az egysejtű élőlényektől az emberig találjuk meg őket. Az 1990-es évek végi felfedezésük óta a család számos taggal bővült, jelenleg tizenöt humán formint kódoló gént ismerünk, amelyről átíródó fehérjék hét családba sorolhatóak. Bizonyos forminok diszfunkciója betegségekhez vezethet, mint a krónikus limfómás leukémia, petefészek-elégtelenség vagy különböző típusú rákos megbetegedések. A forminok doménszerkezetű molekulák, azaz egyes régióikhoz jól meghatározott funkciók köthetőek. Azonosításuk az úgynevezett formin homológia (FH) 1 és 2 domének megléte alapján történik. Ma már tudjuk, hogy az FH2 domén a fehérje legkonzerváltabb egysége, amely alapvető fontosságú az aktinnal kialakított kölcsönhatásban, az FH1 domén pedig egy másik aktinkötő fehérjéhez, a profilinhez kapcsolódik. Hogyan működik ez a fehérjegépezet, miként képes az aktin filamentumok összeszerelődését elősegíteni?

Ezzel a kérdéssel a 2000-es évek elején, a Dia (Diaphanous-related) formin család működésének szerkezeti és működésbeli jellemzőinek vizsgálata révén kezdtem el foglalkozni. Kutatásaink során partnerünkkel (Prof. Alfred Wittinghoffer, Max Planck Intézet, Dortmund, Németország) elsőként határoztuk meg a Dia formin izolált FH2 doménjének atomi felbontású térszerkezetét. A funkcionális vizsgálataink azonban arra világítottak rá, hogy ez a régió nem elegendő az aktin polimerizációjának gyorsításához, épp ellenkezőleg, gátolja ezt a folyamatot. Azonosítottunk egy rövid (72 aminosavból álló), az FH2 domént megelőző szakaszt, ami két FH2 domén összekapcsolódását, vagyis dimerizációját biztosíthatja. Megmutattuk azt is, hogy a dimerizáció alapvető szerepet játszik abban, hogy a Dia fehérjék hatékony aktin filamentumösszeszerelő faktorként működjenek, mégpedig feltételezhetően úgy, hogy az FH2 dimer az instabil nukleációs magok szerkezetét stabilizálja (Shimada, 2004).

A későbbiekben kutatócsoportom érdeklődése a DAAM-család (Dishevelled-associated activator of morphogenesis) forminjaira terelődött. Bár a forminok FH2 régiója alapvető fontosságú a forminok aktinnal kialakított kölcsönhatásában, érdekes módon azt találtuk, hogy a DAAM ezen régiója önmagában semmilyen módosulást nem okoz az aktin sejtvázban, míg az FH1–FH2 domének együttesen drámai morfológiai és dinamikai változásokat képesek előidézni (Barkó et al., 2010). A megfigyeléseink pontosabb megértése érdekében izolált FH2 és FH1–FH2 doméneknek az aktin polimerizációjára kifejtett hatásait tanulmányoztuk teljes belső visszaverődésen alapuló fluoreszcencia-mikroszkópia (TIRFM)1 módszerével. A technika viszonylag új, első gyakorlati alkalmazása az 1990-es évek végére tehető. Ez a speciális fénymikroszkópiai eljárás egy optikai jelenség, a teljes belső visszaverődés során keletkezett, ún. evaneszcens (tovatűnő) elektromágneses mező révén lehetővé teszi a

vizsgálandó minta csupán egy vékony rétegének szelektív megvilágítását. Így, a hagyományos fluoreszcencia-mikroszkópiai technikákkal szemben a TIRFM alkalmazása segítségével egyedi aktin filamentumokat tehetünk láthatóvá (1. ábra). Ez pedig lehetőséget ad a polimerizáció egyes szakaszaira (nukleáció és elongáció) kifejtett hatások elkülönített vizsgálatára.

A módszer alkalmazásával azt találtuk, hogy mind az FH1–FH2, mind pedig az FH2 domén jelenlétében lényegesen több aktin filamentum volt megfigyelhető, ami arra utal, hogy ezek a régiók képesek felgyorsítani a nukleációs fázist. Azonban, meglepő módon a DAAM ezen szakaszai szinte teljes mértékben gátolták a filamentumok növekedését, az elongációt. Ez a megfigyelés egy külső faktor irányába terelte a figyelmünket. Más forminokkal kapcsolatos vizsgálatok alapján már ismert volt, hogy az FH1 régió profilint képes kötni. Így a fenti vizsgálatainkat elvégeztük ennek a fehérjének a jelenlétében is. Igazán izgalmas megfigyeléseket tehettünk; míg az FH2 domén továbbra is gátoló hatást fejtett ki, az FH1–FH2 régió az eddigiekkel ellentétben profilin jelenlétében elősegítette a filamentumok növekedését. Mindezek arra engedtek következtetni, hogy a profilin molekuláris kapcsolóként szolgál a DAAM funkciójában; a filamentumnövekedést gátló faktorból hatékony filamentumösszeszerelő gépezetté alakítja (Barkó et al., 2010). Kutatásainkkal egy időben más családból származó forminok izolált FH1–FH2 doménjeinek aktivitásai is feltérképezésre kerültek. Az átfogó vizsgálatoknak köszönhetően ismertté vált, hogy az FH1–FH2 szakaszok nélkülözhetetlenek a formin fehérjecsalád megfelelő funkcionalitásában. Talán mondhatjuk, hogy ezek a felismerések jelentették a forminkutatás első forradalmi időszakát.

De ne gondoljuk, hogy a forminfehérjék nem tartogatnak több meglepetést. Együttműködő partnerünk (Mihály József, MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont Genetikai Intézet) Drosophila melanogaster (ecetmuslica) modell rendszerben végzett vizsgálatai feltárták, hogy a DAAM-formin működése igen változatos biológiai funkciókban érhető tetten, és nélkülözhetetlen a különböző szervek morfogenezise, valamint megfelelő működése során. A DAAM, az aktin sejtváz alapvető szabályozó molekulája például az idegsejtek axonális nyúlványainak létrehozásában az idegrendszerben és az idegsejtek közötti kapcsolatok kialakításában (Matusek et al., 2008), a vázizom szarkomerikus vékony filamentumainak összeszerelődésében és az izomösszehúzódásban (Molnár et al., 2014), valamint a légzőrendszer funkcionalitásában (Matusek et al., 2006). E megfigyelések izgalmas kérdéseket vethetnek fel. A DAAM-formin polimerizációt elősegítő hatása hogyan képes ilyen változatos funkciókat eredményezni? Ez az aktivitás áll-e a DAAM különböző biológiai funkcióinak hátterében? Módosítják-e egyéb tényezők az FH1–FH2 aktinnal kialakított kölcsönhatását az egyes funkciókhoz való adaptációhoz? Amennyiben igen, mik ezek az elemek, és miként működnek? Úgy gondolom, hogy ezek a felvetések a forminkutatás új és izgalmas irányát indították el, amely minden bizonnyal érdekes felfedezésekhez fog vezetni, amelyeknek köszönhetően még részletgazdagabb képet kaphatunk majd erről a lenyűgöző molekuláris gépezetről.
 

Kulcsszavak: aktin, formin, polimerizáció, fluoreszcencia-mikroszkópia
 

IRODALOM

Barkó Szilvia – Bugyi Beáta et al. (2010): Characterization of the Biochemical Properties and Biological Function of the Formin Homology Domains of Drosophila DAAM. The Journal Of Biological Chemistry. 285, 17, 13154–13169. DOI:  10.1074/jbc.M109.093914

Bugyi Beáta – Carlier, Marie-France (2010): Control of Actin Filament Treadmilling in Cell Motility. Annual Review Of Biophysics. 39, 449–470. DOI: 10.1146/annurev-biophys-051309-103849

Matusek Tamás – Djiane, Alexandre et al. (2006): The Drosophila Formin DAAM Regulates the Tracheal Cuticle Pattern through Organizing the Actin Cytoskeleton. Development. 133, 5, 957–966. DOI: 10.1242/dev.02266 • WEBCÍM

Matusek Tamás – Gombos Rita et al. (2008): Formin Proteins of the DAAM Subfamily Play a Role during Axon Growth. Journal of Neuroscience. 28, 49. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2727-08.200 • WEBCÍM

Molnár Imre – Migh Ede et al. (2014): DAAM Is Required for Thin Filament Formation and Sarcomerogenesis during Muscle Development in Drosophila. PLOS Genetics. 10, 2. DOI: 10.1371/journal.pgen.1004166 • WEBCÍM

Shimada, Atsushi – Nyitrai Miklós et al. (2004): The Core FH2 Domain of Diaphanous-Related Formins Is an Elongated Actin Binding Protein that Inhibits Polymerization. Molecular Cell. 13, 4, 511–522. DOI: 10.1016/S1097-2765(04)00059-0 • WEBCÍM